实验一收集动物组织的活细胞-RH

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1、实验一收集动物组织的活细胞并计数和测定成活率问题如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板的数量？如何知道水样中某小型生物的数量？如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？实验目的学习机械分离法获得动物组织的活细胞学会使用血球计数板测定细胞悬液的细胞密度掌握活细胞和死细胞的鉴别方法收集动物组织的活细胞从组织中分离单细胞的方法有多种：对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采用机械研磨的方法分离细胞，但这会造成一些细胞的损伤而降低细胞的成活率；对于比重差异较大的细胞，可以采用离心的方法来分离，例如血液

2、中各种血细胞的分离；对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔的方法获得。实验材料小鼠小鼠的抓法：从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。小鼠的处死：颈椎脱位法右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。脾脏淋巴细胞悬液的制备1.机械分离法用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗中，

3、用D-Hank’s液冲洗尼龙布，收集细胞悬液于离心管中。2.低渗溶解红细胞（红细胞溶血）0.87%NH4Cl溶液股骨骨髓细胞悬液的制备冲洗骨髓腔：用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hank’s液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。D-HANK’S液(无钙镁离子的HANK’S液)配方NaCl80.0克Na2HPO4•2H2O0.6克（如为12H2O，则需1.2克）KCl4.0克KH2PO40.6克双蒸水1000毫升原液稀释10倍即为使用液------D-Hank’s液细胞

4、计数和细胞存活率利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细胞计数和细胞存活率的测定。细胞计数一般用血球计数板，细胞存活率的测定一般采用染色法。细胞密度：每ml细胞悬液中的细胞数细胞成活率：总细胞中活细胞所占的百分比血球计数板的结构血球计数板是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网。每一方格网可分为九个大方格。四角4个大方格分别被分为16个中方格。中央大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格

5、。中央大方格共含有400个小方格。双线分隔血球计数板的原理白细胞计数法采用四角4个大方格的区域，适用于细胞较大数量较少的样品红细胞计数法采用中央大方格的区域血球计数板的原理计数室大方格边长为1mm，面积为1mm2，中间平台与盖玻片之间的距离（高）为0.1mm，所以每个大方格的固定容积为0.1mm3。血盖片计数室血球计数板的计数公式1每个大方格的总体积为0.1mm31ml=1000mm3,0.1mm3=10-4ml每角大方格的细胞数×10000=细胞数/ml4角大方格中细胞总数细胞密度=———————————×1044×稀释

6、倍数=细胞数/ml悬液计数规则位于格线上细胞只计上边线和左边线上的，即“数上不数下，数左不数右”由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。注意事项向血球计数板加样前，须将细胞悬液充分摇匀；加样过程中，应避免将细胞悬液滴在盖玻片（血盖片）上，避免有气泡产生；细胞悬液密度过大时，应适当稀释后再计数。加样处细胞密度的结果记录左上角左下角右上角右下角细胞总数稀释倍数细胞密度脾脏淋巴细胞骨髓细胞在×10的低倍镜下计数，细胞为透亮的小圆点。细胞成活率的测定利用染色法，判断细胞的死活；活细胞的细胞膜具有选择通透性，不能被台盼蓝染色，

7、呈无色透明状；死细胞的细胞膜通透性增大，被染成蓝色；细胞总数—死细胞数细胞存活率=———————————×100%细胞总数在载玻片上操作注意事项应在短时间内完成细胞存活率的测定，否则活细胞会被染料毒死而着色，影响实验结果的准确性；应在几个视野下计算死活细胞的数量，避免人为因素的干扰；可以在×40倍的高倍镜下，计算视野中的细胞总数和其中的死细胞数。细胞成活率的结果记录视野1视野2视野3视野4细胞总数死细胞总数细胞成活率脾脏淋巴细胞骨髓细胞血球计数板的计数公式2中央大方格的总体积为0.1mm3中央大方格的细胞数×1000=细胞

8、数/ml5个中方格中细胞总数细胞密度=———————————×25×1045×稀释倍数=细胞数/ml悬液每一方格网可分为九个大方格。中央大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。中央大方格共含有400个小方格。双线分隔实验报告实验过程中将原始数据记录在实验讲义中；在实验报告纸上进行实验数据