实验1DNA提取纯化检测-jgh

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1、实验一真核细胞染色体DNA的分离、纯化和检测实验目的通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。红细胞裂解液裂解红细胞细胞裂解液裂解白细胞用蛋白酶K水解蛋白质有机溶剂酚、氯仿抽提在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体DNA基因组提取实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分

2、子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。琼脂糖凝胶电泳实验原理纯净的DNAA260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8纯净的RNAA260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0如果制备的DNA样品A260/A280<1.7，说明样品中含酶和蛋白

3、质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；A260/A280>2，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。DNA浓度测定实验原理实验材料红细胞裂解液KHCO31g(10mM)NH4Cl8.3g(155mM)EDTA·Na237mg(0.1mM)裂解

4、缓冲液（lysisbuffer）10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MEDTA(pH8.0)0.5%(m/v)SDSACD抗凝液柠檬酸0.48g柠檬酸钠1.32g右旋葡萄糖1.47g加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1mlACD液组织细胞动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下保存数天或-70℃下长期冻存，备用。酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）70%乙醇TEbufferRNAse琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统实验材料染色体DNA的制备方法1.取

5、800μl抗凝血液置于5ml离心管中。2.往管中加3ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上5分钟，期间间歇摇动几次。3.4000rpm，室温离心5分钟，弃上清。4.往管中加入3ml红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上5分钟，期间摇几次。5.4000rpm，离心5分钟，弃上清。6.重复步骤4、5四至五遍，至出现明显白色沉淀。将残余红细胞弃去，留下白色沉淀。7.用1×PBS3ml洗涤所得沉淀。8.4000rpm，离心5分钟，弃上清。9.每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)，重悬细胞，加入20μlprotein

6、aseK（20mg/ml），混匀后转移至1.5ml离心管，置55℃水浴1小时。10.加入酚：氯仿500μl，混匀后10000rpm，离心5分钟，取上清，至1.5ml离心管，加入氯仿500μl，混匀后10000rpm，离心5分钟，取上清至5ml离心管。（两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm)11.加入1ml无水乙醇,轻轻混匀可见DNA凝集。12.12000rpm，离心2分钟，弃上清。13.用1ml70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm，离心2分钟，弃上清。14.开盖室温干燥沉淀5分钟。15.加入30μlDDW（无菌水

7、）溶解DNA,取10μl电泳。16.加入3mlDDW至剩余样品中，测OD260和0D280，计算DNA浓度及OD260/0D280。染色体DNA的制备方法琼脂糖凝胶电泳方法1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。2.将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。3.制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂

8、糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。4.待凝胶溶液冷至50℃左右时，在凝胶溶液中加入EB（终浓度0.5μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。5．待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后