实验1DNA提取纯化检测-jgh

实验1DNA提取纯化检测-jgh

ID:39524336

大小:298.32 KB

页数:18页

时间:2019-07-05

实验1DNA提取纯化检测-jgh_第1页
实验1DNA提取纯化检测-jgh_第2页
实验1DNA提取纯化检测-jgh_第3页
实验1DNA提取纯化检测-jgh_第4页
实验1DNA提取纯化检测-jgh_第5页
资源描述:

《实验1DNA提取纯化检测-jgh》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库

1、实验一真核细胞染色体DNA的分离、纯化和检测实验目的通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。学习琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。红细胞裂解液裂解红细胞细胞裂解液裂解白细胞用蛋白酶K水解蛋白质有机溶剂酚、氯仿抽提在高盐条件下,用乙醇沉淀DNA再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体DNA基因组提取实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定,后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分

2、子在高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动,在用电泳法测定DNA分子大小时,应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应,使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定,提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压,也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。琼脂糖凝胶电泳实验原理纯净的DNAA260/A280=1.8,制备的DNA样品应该为1.7~1.8纯净的RNAA260/A280=2.0,制备的RNA样品应该大于2.0如果制备的DNA样品A260/A280<1.7,说明样品中含酶和蛋白

3、质过高,应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提,再用乙醇沉淀DNA;A260/A280>2,说明样品中RNA过高,可用RNase消化后,用酚、氯仿、异戊醇抽提,再用乙醇沉淀DNA;如果样品A260/A280为1.8~2.0,说明样品中盐的含量过高,样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。DNA浓度测定实验原理实验材料红细胞裂解液KHCO31g(10mM)NH4Cl8.3g(155mM)EDTA·Na237mg(0.1mM)裂解

4、缓冲液(lysisbuffer)10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MEDTA(pH8.0)0.5%(m/v)SDSACD抗凝液柠檬酸0.48g柠檬酸钠1.32g右旋葡萄糖1.47g加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1mlACD液组织细胞动物血液样品,将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀,0℃下保存数天或-70℃下长期冻存,备用。酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)70%乙醇TEbufferRNAse琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统实验材料染色体DNA的制备方法1.取

5、800μl抗凝血液置于5ml离心管中。2.往管中加3ml红细胞裂解液,轻摇数次,置冰上5分钟,期间间歇摇动几次。3.4000rpm,室温离心5分钟,弃上清。4.往管中加入3ml红细胞裂解液,重悬沉淀,冰上5分钟,期间摇几次。5.4000rpm,离心5分钟,弃上清。6.重复步骤4、5四至五遍,至出现明显白色沉淀。将残余红细胞弃去,留下白色沉淀。7.用1×PBS3ml洗涤所得沉淀。8.4000rpm,离心5分钟,弃上清。9.每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液(每小组配制1ml),重悬细胞,加入20μlprotein

6、aseK(20mg/ml),混匀后转移至1.5ml离心管,置55℃水浴1小时。10.加入酚:氯仿500μl,混匀后10000rpm,离心5分钟,取上清,至1.5ml离心管,加入氯仿500μl,混匀后10000rpm,离心5分钟,取上清至5ml离心管。(两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm)11.加入1ml无水乙醇,轻轻混匀可见DNA凝集。12.12000rpm,离心2分钟,弃上清。13.用1ml70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm,离心2分钟,弃上清。14.开盖室温干燥沉淀5分钟。15.加入30μlDDW(无菌水

7、)溶解DNA,取10μl电泳。16.加入3mlDDW至剩余样品中,测OD260和0D280,计算DNA浓度及OD260/0D280。染色体DNA的制备方法琼脂糖凝胶电泳方法1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平,检查稳压电源与正负极的线路。2.将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端,防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳,垂直架在电泳板负极的一端,使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。3.制备琼脂糖凝胶:按照被分离DNA分子的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂

8、糖,溶解在电泳缓冲液中,大电泳槽约160毫升,小电泳槽约35毫升凝胶液,置微波炉或水浴锅中加热,至琼脂糖全部溶化。4.待凝胶溶液冷至50℃左右时,在凝胶溶液中加入EB(终浓度0.5μg/ml),摇匀,轻轻倒入电泳板上,除去气泡。5.待凝胶冷却凝固后(约30分钟),在电泳槽内加入电泳缓冲液,大电泳槽约需1200ml,小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板,放入电泳槽,然后

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。