《基因工程四要素》PPT课件

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1、第二节基因工程四大要素四大要素解决5大操作元件的几个问题1、用什么来”切“？”切“什么？2、用什么来”接“？”接“什么？3、”转“入哪里？4、怎样“增”？5、怎样“检”？人工合成、酶切、PCR、文库、cRNA重组产物目的基因克隆载体连接重组DNA分子细菌中原核表达在植物中表达（转基因植物）在酵母中表达病毒中表达分离纯化上游技术下游技术酶切酶切转化感受态宿主细胞目的基因被克隆增殖构建其表达载体转化感受态宿主细胞PCR和酶切鉴定SouthernNorthernWestern筛选检测鉴定操作单元操作对象所用工具或方法切载体目的基因工具酶接载体目的基因工具酶转转目的基因入受体细胞

2、（宿主细胞）物理或化学方法增体内体外受体细胞中的目的基因受体细胞的培养检受体细胞中的目的基因Southern工具酶载体目的基因受体四大要素一、工具酶（一）限制性内切核酸酶P211、概念一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。限制与修饰系统：限制（Restriction）将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断;修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割由1973年H.OSmith和D.

3、Nathans提议的命名系统由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。1、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoRI，EcoRV。命名原则？P21目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶I类限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶限制与

4、修饰系统的种类？P21识别的长度切割的位点P22识别的结构2、限制性内切核酸酶识别序列P21书写：以5‘→3”走向的单链DNA核苷酸表示左右互补同裂酶：P22来源不同，识别序列相同，酶切位点相同或不同。GAATTCCTTAAGGCTTAA1、黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5’粘性和3’粘性）AATTCG3、切割方式P22同尾酶：P22内切酶切割的位点不同，但具有相同的黏性末端，这一组酶成为同尾酶。平末端：4、应用（1）限制酶切割位点提供了DNA物理图谱的特异性标记（2）酶切产生的特异性片段可用分子克隆的手段

5、加以纯化（3）酶切产生的片段为各种各样的其他DNA酶学操作提供了基本底物。5、DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求对引物设计的指导：在引物末端加上一定数目的碱基数目体现内切的特征加尾操作(二)DNA连接酶:P25作用：可以把两种来源的DNA（用同一种限制酶切割）的黏性末端黏合起来。（以下几种情况）同裂酶，行不？P25失去了两种酶的识别序列酶的识别序列仍存在3`5`磷酸二酯键两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端功用：DNA重组中促使载体与DNA连接限制性内

6、切酶—主要用于DNA分子的特异切割（“分子剪刀”或“分子手术刀”“基因刀”之称）核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接（三）其它工具酶：1、甲基化酶：---来自细菌防御系统甲基化对限制酶切的影响（1）、修饰酶切位点----使本可被酶切的不受酶切（2)、产生新的酶切位点－－－使本不能被酶切的能被酶切(3)、对基因组作图的影响2、DNA聚合酶(DNApolymerase)—来自DNA复制系统催化DNA的合成活性（主要活性）：把dNTPs连续地加到引物的’3’—OH端，催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共同特点）其他活性（相辅助的活性）3、耐热DNA聚合酶来源：噬高温的细菌。基本特

7、性：在高温下具有活性（90-100℃）用途：主要用于PCR4、反转录酶（reversetranscriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶（以RNA为模板）基本特性：5’→3’合成DNA活性，但无3’→5’外切酶活性主要用途：cDNA克隆中合成第一条链/提取RNA反转录成DNA，再PCR（因为内含子的存在）转录酶--RNA聚合酶（RNApolymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关5、末端转移酶来源：小牛胸腺基本特性：不依赖于模板的D