基因芯片分析的理论与方法

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1、基因芯片分析的理论与方法基因芯片概论基因芯片分析的概念基因芯片(Genechip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。基因芯片分析的优点快速高通量(104-106)自动化使用的试剂少低成本基因芯片分析的应用范围AcademicresearchofgeneticdiseasesCancerPrenatalgenetics（产前遗传学研究）GeneralgeneticdiseasesInf

2、ectiousdiseasesDrugdiscoveryAnimalfarming/veterinaryIndustrial(fermentation)Environmental发展的方向:从多角度研究揭示生命现象Stages:developmental,transformation,timeftertreatment,etc.Treatments(stimuli,drugs,nutrients,etc.)Physiologicalstates(stressed,fasting,etc.)Tissuedistribution(position,3D)基因芯片的发展是推动系统生物学发

3、展的动力利用基因芯片研究生命现象的测略Factorsinvolved=>ComponentsOrderofevents=>PathwaysInteractions=>CircuitKEGGGO基因芯片的分类根据用途分类geneexpressionpatternBiologicalSampleFunctionalInformation基因芯片的分类Oligonucleotidearray–Synthesizedonachip（Affymetrix）–Spotonasolidmatrix（Compugen）cDNAarray（Incyte）根据探针类型分类expressiongenom

4、icanalysiscDNA-ChipGenomicChip<2,000n>50,000n一些发展中的基因芯片技术平台利用生物分子的电物理特性进行基因表达监测：监测速度很快，适用于基因表大，蛋白质组及基因型的研究利用电场原理进行高密度芯片生产：基于适合用于生物学的集成电路，集成电路包含可以独立寻址的微电极阵列，结合特殊的液体流动系统，可以使大部分生物分子按照来自于计算机的数字指令运动。喷墨点样技术：以高度定位的形式把合成好的寡核苷酸分子喷点倒玻璃表面。寡核苷酸包被的微珠芯片平行信号测序技术：对基因表达进行定量分析基因芯片分析试验方法基因芯片分析的主要步骤cDNA基因芯片分析的主要步

5、骤cDNA芯片分析的主要步骤SpotbyArrayspottercDNA芯片分析的主要步骤HybridizingbyAutomatichybridizationprocessorcDNA芯片分析的主要步骤LaserscannerOligonucleotidearray（GeneChip）LLLLLLLLcDNAAAAA总RNA的制备反转录体外转录生物素标记的cRNA片段化处理带标记的cRNA片断35-200bases0.5-2ug/ul起始用量5-10ug（IVT）操作流程（以真核生物为例）LLLLL标记的cRNA片断杂交混合液的制备EukaryoticHyb.ControlCo

6、ntrolOligoB2杂交（16hour）数据分析扫描洗脱染色Oligonucleotidearray的特点1个平方厘米的面积至少可排列四十多万个探针合成区（“点”）基因2基因1cDNA基因2cDNA用于cDNA芯片的探针Oligoprobe基因1多个检测结果可以参考Oligonucleotidearray的优越性序列准确性高原位合成PCR扩增,点样起始TotalRNA1－10ug≥50ug均一的退火温度25mer300bp－3Kb特异性更高多段探针单个探针非特异性杂交≤2％30％cDNA芯片Affy芯片优势芯片分析数据的标准化Quantitationdata-qualityas

7、sessments背景处理：图像上各点的吸光度值包含了样品和背景信号，在提取数据前必须将背景扣除杂交点质量：由于点样或膜变形等原因目前较多的软件对杂交点的识别定位仍需要人为的调整数据的标准化：其目的是避免基因芯片实验中因系统差异造成芯片间数据比较的困难。最常用的是“看家基因”法，它预先选择一组表达水平不变的看家基因，计算出这组基因平均ratio值为1时的标准化系数，然后将其应用于全部的数据以达到标准化的目的ScatterplotsforaCy5-liver/Cy3-l