微生物代谢工程——终极版1

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1、微生物代谢工程——终极版1微生物代谢工程1.代谢控制发酵代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。2.13微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段定义：应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之

2、，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。研究内容：(1)代谢流的定量和定向(2)细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析(3)研究胞内代谢物浓度的反应工程方法(4)用13C标记实验进行胞内稳态流分析研究手段(1)采用遗传学手段的遗传操作①基因工程技术的应用。②常规诱变技术的应用。(2)生物合成途径的代谢调控①生物合成中间产物的定量生物测定。②共合成法在生物合成中的应用。③酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏。④无机磷对生物合成的调节。(3)研究生物合成机制的常用方法①刺激实验法。②同位素示踪法。③洗涤菌丝悬浮法。④无细胞抽提法。⑤遗传特性诱变法。3.工业发酵的五字

3、策略（图示加文字说明）①进，在育种和发酵控制方面都要促进细胞对碳源营养物质的吸收；②13通，在育种方面解除对某些酶的反馈调节，在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流）能够畅通的注入载流途径，汇入代谢主流，流向目的产物，特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径通畅，代谢主流优势明显③节，采用育种或发酵控制手段，节制与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或以中间产物为起始底物的分支途径；④

4、堵，采用育种或发酵手段消除或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢，为了消除或削弱目的产物的进一步分解代谢，就必须降解目的产物进一步代谢的酶活力或酶量，甚至使这些酶不再合成或不起作用；⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。在育种和发酵控制发面可通过调节细胞对目的产物的通透性，增加输送目的产物的载体蛋白的量，为目的产物输送代谢能的方法，使目的产物尽快转移出细胞。4.酶的阻遏机制，以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明（图示加文字说明）终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制反馈阻遏：组氨酸操纵子：13与His降解代谢有关的

5、两组酶类被称为hut酶,控制这些酶合成的操纵子被称为hutoperon.由一个多重调节的操纵子控制,有两个启动子,两个操纵区及两个正调节蛋白.Hut操纵子共编码4种酶和一个阻遏物.4种酶分别由hutG,hutH,hutI及hutU基因编码,阻遏物则由hutC基因编码.在产气克氏菌中,以上基因构成两个转录单位,hutI,hutG,hutC和hutU,hutH分别被转录合成两条mRNA长链.这两个转录单位各自都有一个启动子和一个操纵区,其转录过程都是从左向右进行的,hutC阻遏物能与每个操纵区相结合.无论以组氨酸作为唯一碳源或氮源,hut操纵子都会处于有活性状态.H

6、ut操纵子的每一个启动子上都有cAMP-CAP结合位点,当碳供应匮乏时,能合成cAMP,出现cAMP-CAP复合物,并与操纵区上的相应位点结合,诱发基因转录.5.13协同反馈抑制，以谷氨酸产生菌（棒杆菌或短杆菌）天冬氨酸族氨基酸代谢途径中反馈调节为例来说明（图示加文字说明）上图为谷氨酸棒杆菌中天门冬氨酸族氨基酸合成过程中的终产物的协同（反馈）抑制机理。协同反馈抑制是指在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用的现象。天门冬氨酸族氨基酸合成起始于天冬氨酸，经过两个分支最终合成终产

7、物赖氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸，而终产物中赖氨酸和苏氨酸协同起来对该途径第一步中的酶天门冬氨酸激酶具有抑制作用，这既为天冬氨酸族氨基酸代谢途径中协同反馈抑制。6.营养缺陷型和结构类似物抗性突变株（以赖氨酸产生菌为例）如何选育获得(1)13营养缺陷型突变株的选育营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM)是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要

8、的天然或半合成培养基。补