土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1

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1、专题2微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素分子的立体结构CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。研究思路美国黄石国家公园的一个热泉(一)筛选菌株水生耐热细菌Taq(Thermusaquaticus)耐高温的TaqDNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌培养基配方三KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4•7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g培养基配方二KH2PO43gMgSO4•7H2O3gN

2、aNO32g葡萄糖10.0g尿素3.0g琼脂15.0g培养基配方一KH2PO43gNa2HPO41.4gNaNO32gMgSO4•7H2O3g葡萄糖10.0g琼脂15.0g（一）筛选菌株——尿素细菌的分离1.原理：根据某种微生物的特殊营养要求或其对物理、化学因素（营养、温度、pH等）的抗性而设计的。选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2.功能：使混合菌群中的目的菌株变为优势菌，从而提高该菌的筛选效果。3.方法：利用选择培养基来实现。（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源

3、于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。同学平板1平板2平板3平均数评价甲230230乙21212256163结论启示没有设置重复组，因此结果不具说服力。1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。统计菌落数

4、目测定微生物数量的方法：1.稀释涂布平板法（活菌计数法）：统计平板上的菌落数2.显微镜直接计数：3.滤膜法：是检测水样中大肠细菌群的方法。4.测定细胞重量法：此法分为湿重法和干重法5.测定细胞总氮量或总碳量利用血球计数板(不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度…)旁栏思考1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。（三）设置对照在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只

5、选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同

6、学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验设计[一]土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。微生物的种类土壤稀释倍数目标分离土壤中所有细菌104、105、106平板上的菌落数应为30～300个，便于准确计数。分离土壤中的放线菌103、104、105分离土壤中的真菌102、103、104分离土壤中的尿素细菌104、105、10

7、6、107（二）土壤稀释二、实验设计旁栏思考2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。1011