《凝胶排阻》PPT课件

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1、第四章凝胶（排阻）层析中国医科大学实验技术中心孙晋民1排阻层析(exclusionchromatography)，亦称分子筛层析(molecularsievechromatography)、凝胶过滤(gelfiltration)。凡是利用生物大分子的相对分子质量(relativemolecularmass，Mr)差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于排阻层析的分离介质称为排阻层析介质。在20世纪60年代初就开始使用凝胶介质分离生物大分子。例如，用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持物分离血清中的蛋白质，凝胶在其中起分子筛作

2、用。后来人们将凝胶制成球形微珠，作为液相层析分离介质，用于分离生物大分子，并获得巨大成功。现在使用的凝胶层析介质的用途远远超出了电泳分离介质的范畴，已成为分离纯化生物大分子最重要的分离介质之一，也是作为合成带有配基的层析介质应用最广泛的一种载体。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。第一节概述2第二节凝胶层析原理一、基本原理凝胶类层析介质是一种在球体内部具有大孔网状结构凝胶微粒，不同大小的网状孔径像筛子一

3、样，可以把大小不同的生物大分子按一定的顺序进行分离，好像“目数”不同的普通筛子一样把大小不同颗粒分级筛分。但是排阻层析与普通筛分的原理不同，排阻层析是按生物分子分子量的大小排序进行筛分的。3相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径近，在柱内的停留时间短，保留值小，所以在层析过程中迁移率最快，走在小分子的前面，先从柱中流出；4分子量小的分子由于能够进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状孔流过，相对于大分子迁移的路径长，在柱

4、内的停留时间长，保留值大，所以在层析过程中迁移率最慢，走在大分子的后面，后从柱中流出。5样品中分子量大小不同的各种分子在流过凝胶内部网状孔时就受到凝胶介质排阻效应，也称为分子筛效应，将它们一个一个分离，从而达到分离的目的。普通筛分是大颗粒不能通过筛子的筛孔而被截留在筛板的上面，小颗粒可以通过筛孔。所以普通筛分与凝胶层析筛分的原理是不一样的。排阻层析分离的基本原理如图所示。67凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。第一部分是全排阻分子，也可称之为上限分子量，不能起筛分作用的大分子。第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介

5、质有效分离的分子。第三部分是全渗透分子，称之为下限分子量，是不能起筛分作用的小分子。8从图可以看出，A-B之间为该凝胶的有效分离范围，可分离相对分子质量范围是1000～100000，高于相对分子质量为100000的是全排阻分子，低于相对分子质量为1000的是全渗透分子。凝胶层析的分离范围示意图9二、参数的表示方法及其意义1.柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(totalvolume)表示，单位为ml。2.外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙

6、所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积，以Vo(outervolume)表示，单位为m1。103.内水体积是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积以Vi(innervolume)表示，单位为m1。4.凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积，也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积,以Vg(gelvolume)表示，单位为m1。115.洗脱体积自加样液时开始，到洗脱组分浓度最大时出现的峰(洗脱峰峰顶)为止，所收集的体积，以Ve(el

7、utionvolume)表示，单位为m1计算法：根据层析柱体积计算总体积可用下列公式表示Ｖt=πr2h干凝胶用量（克）＝πr2h／膨胀度（床体积／克干胶）12三、参数之间的关系测量法1.床体积与Vo，Vi，Vg之间的关系式是：Vt=Vo+Vi+Vg(1-1)2.洗脱体积与Vo，Vi的关系式为：Ve=Vo+KdVi(1-2)式中Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配系数，也可以视为相对分子质量不同的溶质在凝胶颗粒的内部和外部的分配系数。它只与被分离物质相对分子质量的大小、凝胶颗粒空隙和网状孔径大小有关，与层析柱的长短和粗细

8、无关。Kd可以通过实验获得。133.Kd与体积之间的关系可以将式(1-2)变换一下，即可得到Kd与体积之间的关系式：(1-3)Ve–VoVi式中Ve-实验测得的实际洗脱体积。可用不被凝胶滞留的大的相对分子质量组分测得，通常用相对分子质量在2×106的蓝色葡聚糖-2000测定，可以通过干胶的吸水量(每克干