叶绿素的提取、分离和测定

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1、实验四叶绿素的提取、分离和含量测定一、叶绿素的提取、分离（一）原理叶绿体中含有叶绿体色素（叶绿素a和b、胡萝卜素及叶黄素）。这些色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用酒精或丙酮等提取。并可根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，将它们彼此分离开。（二）仪器和药品研钵、吸管、小烧杯、试管、培养皿等95%酒精、石油醚碳酸钙（三）步骤1、用天平称取15g鲜叶，剪碎放入研钵中，加少量的CaCO3粉末及95%酒精5-10mL研成糊状，再加95%酒精20mL，充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，5-10分钟后，过滤入三角烧瓶中加塞待用。2、取一张色层分析纸或定性滤纸代用

2、，剪成圆形，直径应略大于培养皿的直径；将圆形滤纸平放在培养皿上，用滴管吸取叶绿素提取液，滴在滤纸的中心位置，稍干后，再重复操作几次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢地推动叶绿素提取液，不久即可看到分离的各种色素的同心圆环,由内到外依次为：叶绿素a为蓝绿色、叶绿素b为黄绿色、叶黄素呈鲜黄色、胡萝卜素为橙黄色。二、叶绿素a和b含量的测定（一）原理叶绿素a、b在长波方面的最大吸收峰分别为为663nm和645nm。同时在该波长时叶绿素a、b比吸收系数k为已知，根据Lambert—Beer定律列出浓度C与光密度OD之间的关系式：OD663=82.04Ca+9.27CbOD645=16.75C

3、a+45.6CbCa、Cb为叶绿素a、b的浓度，单位mg/L解方程式得Ca=12.7OD663-2.69OD645Cb=22.9OD645-4.68OD663Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663(二）步骤1、称取0.5g叶片，剪碎后置于玻璃匀浆器中加纯丙酮5mL，研成匀浆，用80%丙酮10mL洗匀浆器，用80%丙酮定容到25mL，避光静置5min。用移液管吸取上面的绿色清液1mL置于一大试管中，加入丙酮4ml稀释，摇动试管，作测定用。2、测量光密度值取上述提取液以80%丙酮作为空白对照，于663及645nm下读取光密度值三、实验结果计算结果代入公式求出各叶绿素的含

4、量（单位mg/L）最后计算时需考虑稀释因子叶绿素a含量（mg/g鲜重）=CA*5*25*2/1000=0.25CA叶绿素b的含量（mg/g鲜重）=0.25CB叶绿素总含量（mg/g鲜重）=0.25CT