变性梯度凝胶电泳PCRDGGE

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1、变性梯度凝胶电泳——从实验到分析2011年9月X日变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE)最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分

2、子生物学方法之一。变性梯度凝胶电泳(DGGE)变性梯度凝胶电泳（DGGE）:一种分离相似大小DNA片段的电泳方法。即双链DNA在变性剂(如尿素或甲酰胺)浓度或温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于Tm值不同，DNA的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16sRNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异，其中不同土壤微生物的16sRNA基因的V3区扩增的DNA片断在DGGE中的应用最为广泛，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的

3、种类多少，粗略分析土壤样品中微生物的多样性。变性梯度凝胶电泳(DGGE)环境样品基因组DNA的提取目标片段的PCR扩增DGGE图谱的分析图像的采集和条带的回收DGGE分析电泳前准备工作电泳分析剥胶、染色DGGE条带测序DGGE分析微生物群落的主要步骤总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率。②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性。③制备DNA花费时间的长短。关于DNA提取的建议：优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/

4、酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品）。环境样品基因组DNA的提取选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程。环境样品目标片段的扩增最好采用TouchdownPCR。注意PCR的环境，V3区产物扩增极易污染。目标片段的PCR扩增细节决定成败！DGGE分析从这一步开始，带上手套。配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头

5、，甚至物品摆放的位置。制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。DGGE前的准备工作DGGE制胶主体部件：上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。上样时上样器要深入胶孔底部。尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有markerlane。将胶放入电泳槽中时注意正负极。建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。电泳停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源剥

6、胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。染色前做好胶样品顺序的标记。银染、EB染色和SYBRGreen染色。剥胶与染色——垂直电泳凝胶变性梯度的确定关于PCR产物的纯化和定量关于DGGEmarker的制作获得高质量的DGGE图谱。DGGE条带的回收－－注意紫外条件下操作的安全。－－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。－－不同长度目标片段从切胶条带中的回收。测序注意要点－－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆－－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序－－每个条带至少测3个克隆图像的采集和条带的回收DGGE图谱的聚类分析、相

7、似性分析DGGE图谱的分析DGGE图谱的主成分分析DGGE图谱的数字化——QuantityoneDGGE图谱的数字化后的主成分分析用QuantityOne（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（Shannon-Wienerindex）其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度（heightofthepeak）占该泳道总灰度的比例。菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=lnS多样性指数的计算Quantityone的应用问题和讨论