分子生物学研究方法朱玉贤

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1、第五章.分子生物学研究方法第一节基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbrom

2、ide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。DNA的脉冲电场电泳技术:PFGE-Pulse-fieldgelelectrophoresis2．核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleica

3、cidblotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。3．细菌的转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2

4、处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异

5、性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图b．DNA序列分析自动化(分析反应读片过程)用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。DNA测序的全过程(实际)5．基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因

6、的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。如：盒式诱变(cassettemutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gelretardationassay)，又称DNA迁移率变化试验(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）主要步骤：①用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；②加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，

7、DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；⑤进行DNA凝胶分析。如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。7.PCR技术（基因的体外扩增法）(1).概念PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。经过n轮PCR扩增循环,理论上可以