开题报告-吴雪丽

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1、毕业设计（论文）开题报告题目：目的基因的合成及其连接、转化与筛选学院：化学与材料工程学院专业：生物工程学号：20074学生姓名：吴雪丽指导教师：徐玲花2011年03月15日1、课题来源学校命题2、研究目的和意义基因工程一般包括四个方面的基本内容：一是取得符合人们的要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA（质粒和病毒DNA称作载体）；三是把重组DNA引入某种细胞（称为受体细胞）；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。首先，要把所需基因——目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔

2、·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。DNA的分子链切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1967年，世界上有5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片体。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。基因的理想运载工具是病毒和噬菌体，病毒不仅在同种生物之间，甚至可以在人和兔培养细菌细胞转移。还有一

3、种理想的载体是质粒。质粒能自由进出细菌细胞，当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故地能自我复制。因此，它是一种理想的运载体。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就如可以愿以偿了。将目的基因与质粒经过内切酶的“裁剪”，然后靠连接酶的作用，将目的基因和质粒（或病毒DNA）重新组合起来形成重组DNA。重组DNA就能在质粒（或病毒DNA）的“带领”下进入受体细胞。从生物体内提取DNA不仅过程繁琐而且效果较差，通常含有蛋白质等杂质；而人工合成基因就可以避免这些问题，并且效果良好。人工合成基因多采用PCR技术（聚合酶链技术）。人工合成基因在生

4、命科学研究中有着重要的意义，也是一项常有的技术。现代化工业生产中人工合成基因的方法很多，但往往过程复杂，成本较高。因此探索了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法。,建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要。3、国内外研究现状和发展趋势及综述20世纪40年代，Avery在美国的一次学术会议上首次报道了肺炎双球菌的转化，不仅证明了DNA是生物的遗传物质，而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌，理论意义十分重大。1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，即DNA分子是由A（腺嘌呤核苷

5、酸）、G（鸟嘌呤核苷酸）、C（胞嘧啶核苷酸）、T（胸腺嘧啶核苷酸）四种核苷酸按一定的顺序排列而成，成双螺旋结构。DNA的半保留复制机制。1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶HindⅡ，使DNA分子的切割成为可能。1972年，Bover实验室又发现了名叫EcoRⅠ的核酸内切酶，这种酶每遇到GAATTC序列，就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。以后，又相继发现了大量类似于EcoRⅠ这样的限制性核酸内切酶，这样是研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供了技术基础。基因工程技术突破的另一发现是DNA连接酶。1967年，世界上

6、有5个实验室几乎同时发现DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种具有更高连接活性的DNA连接酶——T4DNA连接酶。根据1972年前后微生物遗传学的研究成果，有可能用作基因克隆的载体有病毒、噬菌体和质粒等不同的小分子量的复制子。鉴于多年以来分子生物学家一直把注意力集中在病毒与其寄生细菌之间的相互关系上，因此很自然地在一开始就选定噬菌体作为基因克隆的最理想载体。其中研究最深入，而且业已被改建成实用克隆载体是噬菌体载体、质粒分子。特别是属于抗药性R因子的质粒分子，具有分子量小、易于操作和具有抗药性选择记号等优点，目前已被发展

7、成为基因分子克隆中最常用的载体，如Pbr322和pUC13等质粒载体就是其中突出的代表。1970年M.Mandel和A.Higa发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙的适当处理之后，便能够吸收入噬菌体的DNA。1972年，斯坦福大学的S.Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能够摄取质粒的DNA。从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的转化受体。1972年，美国斯坦福大学的P.Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶EcoRⅠ,在体外对猿猴病毒SV40的DNA病毒分别