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《磁珠富集与液相色谱-质谱联用结合筛选枳壳中脂肪酶抑制剂》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、Vol.33高等学校化学学报No.122012年12月摇摇摇摇摇摇CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES摇摇摇摇摇摇2692~2696磁珠富集与液相色谱鄄质谱联用结合筛选枳壳中脂肪酶抑制剂1121陈摇锥,陶摇益,王摇怡,王摇毅(1.浙江大学药物信息研究所,杭州310058;2.天津中医药大学中医药研究院,天津300193)摘要摇提出了一种磁珠收集与液相色谱鄄质谱联用(LC鄄MS)结合用于快速筛选中药提取物中的脂肪酶抑制剂的方法.通过制备键合脂肪酶的磁珠,将其与枳壳总黄酮孵育后,筛选出枳壳中脂肪酶
2、的配体.通过LC鄄MS分析发现,4个化合物均是潜在的脂肪酶抑制剂,鉴定其分别为柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和枸橘苷.对4个化合物进行了体外脂肪酶抑制活性验证.研究结果表明,新橙皮苷、橙皮苷和枸橘苷具有显著的脂肪酶抑制活性,IC分别为48郾04,52郾45和46郾18滋g/mL,其中枸橘苷具有脂肪酶抑制活性为首次报道.结果表明,50磁珠富集与LC鄄MS集成技术能够用于快速发现中药活性成分.关键词摇脂肪酶;磁珠富集;枳壳;配体筛选中图分类号摇O629摇摇摇摇文献标识码摇A摇摇摇摇doi:10.7503/cjcu20120436S脂肪酶是
3、催化体内三酰甘油水解的关键酶.食物中的脂肪在胰脂肪酶和胃脂肪酶的作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸,在肠道内被吸收,然后在体内重新合成脂肪,造成脂肪堆积,最终可导致[1,2]肥胖.因此,脂肪酶抑制剂可通过抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用,达到减少脂肪吸收、[3,4][5,6]控制和治疗肥胖的作用.临床用于治疗肥胖的药物,如奥利司他等是典型的脂肪酶抑制剂.迄[7]今,人们已经从植物中发现了很多天然的脂肪酶抑制剂,如何快速筛选出新的脂肪酶抑制剂成为目前研究的热点.常规的脂肪酶抑制剂筛选方法为均相溶液酶法,即以溶液酶作为酶源,与抑
4、制剂共同孵育一段时[8]间后,通过相关指标来检测溶液酶的活性,从而评价抑制剂对酶活性的抑制效果.如Nakai等选择4鄄甲基伞形酮油酸酯作为底物,将酶与底物孵育后,通过分光光度法评估待测物对脂肪酶的抑制活性.这种方法需与活性追踪分离等方法相结合,才能从混合物中筛选出活性化合物,因此需要较长的研究周期.近年来,采用固相酶法筛选活性化合物引起人们的关注.该方法是将酶或靶标蛋白固定在某种[9]合适的载体上,通过筛选等方式富集和分离与酶特异性结合的配体.磁性颗粒作为一种酶或靶标蛋[10,11][12]白的固定载体,已用于筛选具有酶抑制活性
5、的化合物,如Marsza覥覥等使用键合黑色素的磁珠筛[13]选先导化合物;Liu等使用键合牛血清蛋白(BSA)的磁性纳米氧化铁颗粒从野葛花中筛选BSA的配[14~16]体;Qing等使用键合人血清白蛋白(HSA)的磁珠从穿山薯蓣和黄山药中筛选可与HSA结合的薯蓣皂苷,还在磁珠表面键合琢鄄葡萄糖苷酶和蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B),并从石榴皮中筛选出[17]了琢鄄葡萄糖苷酶和PTP1B的抑制剂;Yasuda等制备出表面包被SIRT6的磁性颗粒,并从胡芦巴种子提取物中筛选出SIRT6抑制剂.但迄今采用脂肪酶键合磁珠筛选脂肪酶
6、抑制剂的研究仍鲜见报道.本文选择脂肪酶作为筛选靶标,采用磁珠收集与液相色谱鄄质谱联用(LC鄄MS)结合的方法从枳壳提取物中筛选潜在的脂肪酶抑制剂,为快速发现中药药效物质提供了一种新的研究思路.收稿日期:2012鄄05鄄04.基金项目:国家“重大新药创制冶科技重大专项课题(批准号:2012ZX09304鄄007)和国际科技合作项目(批准号:2009DFB30510)资助.联系人简介:王摇毅,男,博士,副教授,主要从事中药药效物质快速发现技术方面的研究.E鄄mail:mysky@zju.edu.cn摇No.12摇陈摇锥等:磁珠富集与
7、液相色谱鄄质谱联用结合筛选枳壳中脂肪酶抑制剂26931摇实验部分1.1摇试剂与仪器1.1.1摇样品与试剂摇枳壳总黄酮提取物购自长沙康尔佳制药集团有限公司;脂肪酶(提自猪胰酶)、1鄄乙基鄄3鄄(3鄄二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2鄄(N鄄吗啡啉)乙磺酸(MES)、N鄄羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4鄄甲基伞形酮油酸酯和柚皮苷均购自Simga公司;羧基磁珠(粒径1郾05滋m,浓度10mg/mL,3密度1郾8g/cm)购自Invitrogen公司;橙皮苷和新橙皮苷购自上海融禾医药科技发展有限公司;枸橘苷购自上海同田生物技术股份有限
8、公司;其它试剂均为分析纯.1.1.2摇实验仪器摇Agilent1100型液相色谱系统(美国安捷伦科技有限公司),包括二元高压泵、自动plus进样器、柱温箱和二极管阵列(DAD)检测器;FinniganLCQDecaXP离子阱质谱仪,配有电喷雾(ESI)电离源和X
