《硕士毕业论》PPT课件

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1、食品中苏丹红I的免疫学快速检测方法研究fuyunjie1985@163.com前言苏丹红I（1-苯基偶氮-2-萘酚），属于苏丹红染料的一种，作为化学合成染料，主要应用于鞋油、化妆品等工业产品及其他着色剂等领域。苏丹红I在体内代谢，可被还原为初级代谢产物苯胺和1-氨基-2-萘酚，这些物质会攻击肝细胞，引起中毒性肝病，也可造成神经系统损害，是一种遗传毒性致癌物。苏丹红I前言-苏丹红I检测现状目前食品中苏丹红I的检测主要辅助仪器（HPLC、IAS-HPLC）进行检测，而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于：1.检测仪器昂贵2.检测成本高

2、3.操作复杂4.耗时长5.需专业人员操作6.不适宜现场抽查及推广应用免疫学检测技术解决食品中苏丹红I快速检测的问题！一.研究内容苏丹红I多抗制备及鉴定研究内容苏丹红I免疫学检测方法建立间接竞争ELISA方法胶体金免疫层析试纸条法1.苏丹红I多克隆抗体的制备苏丹红I多克隆抗体的纯化及含量测定苏丹红I多克隆抗体的制备苏丹红I衍生物-明胶免疫抗原的合成苏丹红I多抗制备免疫原的制备：①利用重氮法合成带有羧基的苏丹红I衍生物②利用混合酸酐法合成苏丹红I-明胶复合物对氨基苯甲酸2-萘酚苏丹红I衍生物苏丹红I衍生物明胶苏丹红I衍生物-明胶1

3、.1苏丹红I免疫原的制备首次免疫：0.5mL完全弗氏佐剂+0.5mL2mg/mL免疫原,于兔背部注射。2周后:0.5mL不完全弗氏佐剂+0.5mL2mg/mL免疫原，足掌注射。每隔10天:于兔耳缘静脉注射免疫抗原1.0mL，加强免疫3次。最后一次免疫后的7～10天试血。2.3苏丹红I多抗的制备选择体重2kg的雄性新西兰兔，按照常规免疫程序，制备多克隆抗体。整个免疫过程为2～3个月。2.4多克隆抗体的纯化辛酸硫酸铵法亲和层析法2.1苏丹红I衍生物的合成结果苏丹红I衍生物红外图谱鉴定a-苏丹红Ib-衍生物b曲线在1700cm-1处

4、存在较强的吸收峰表明反应产物的结构上基本连接羰基。2.2苏丹红I衍生物的色谱分析结果2.3苏丹红I免疫原的合成结果a曲线显示苏丹红I在500nm处有强的特征吸收峰；b曲线显示明胶在220nm处有强的特征吸收峰；c曲线同时具有苏丹红I和明胶的特征，表明苏丹红I与明胶偶联成功。苏丹红I免疫原紫外扫描结果2.4SDS-PAGE测定IgG的纯度M-低分子量Maker；1-苏丹红I抗血清；2-AC纯化抗体；3-CA-AS纯化。苏丹红I抗血清，有多条带，含有较多杂蛋白；2.经CA-AS纯化后，有3-4条较明显的条带，血清经纯化后，大部分杂

5、蛋白被除去；3.经AC纯化后，有两条明显条带，一条为重链，分子量约55KD，另一条为轻链，分子量约14KD，与IgG抗体的重链和轻链的分子量较符合，纯化后的抗体纯度较高。2.5特异性IgG的浓度测定根据BCA法的标准曲线y=0.5198x+0.2464，R2=0.9778，计算得到:辛酸硫酸铵纯化的抗体浓度为4.24mg/mL，亲和层析柱纯化的抗体浓度为1.93mg/mL。BCA法测定蛋白质浓度一.研究内容苏丹红I多抗制备及鉴定研究内容苏丹红I免疫学检测方法建立间接竞争ELISA方法胶体金免疫层析试纸条法2.1间接竞争ELIS

6、A方法的建立1.苏丹红I抗体效价的测定研究内容3.建立间接竞争ELISA检测方法2.苏丹红I抗体亲和力的测定4.待测样品的前处理2.1.1苏丹红I抗体效价的测定抗苏丹红I特异性抗体效价测定效价为1:320002.1.2苏丹红I抗体亲和力的测定本实验利用竞争ELISA法，测定抗体的亲和力。若抗体具备较强的亲和力强，则较少量半抗原即可产生50%的抑制率，故常用IC50，即产生50%抑制率时半抗原的浓度，来表示抗血清的亲和性，以10%抑制率时的苏丹红I浓度作为最低检测限。抑制率=100%-(OD1-OD阴性)/（OD2-OD阴性）×

7、100%，其中，OD1为竞争孔的OD值，OD2为不含苏丹红I孔的OD值。抗血清亲和性IC50：15.0ng/mL，最低检测限IC10：1.0ng/mL。2.1.3间接竞争ELISA的建立酶标记的苏丹红I抗原与待测样品中可能存在的苏丹红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合，显色程度与样品中苏丹红I含量成反比。根据待测样品的OD值，推算出样品中的苏丹红I的浓度。2.1.4待测样品的处理实际添加量(μg/kg)ELISA检测量(μg/kg)加标回收率（%）变异系数(n=3)/(%)4.003.8195.256.68.006.87

8、85.884.916.0015.6597.837.432.030.5695.506.2称取2.0g的空白辣椒粉样品，准确加入10mL乙腈，均质2min，超声15min。滤纸过滤后过无水硫酸钠柱去水，所得溶液用真空旋转蒸发仪40℃旋转蒸干，甲醇-0.02mol/LPBS0.2m