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时间:2019-06-22
《IC50曲线测试实验流程》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、IC50曲线的测定IC50即半抑制率,标准曲线是一个S型曲线。IC50为50%抑制浓度即细胞存活量为对照样本一半时所对应的浓度,半数抑制越低,说明药物对细胞的毒性越高。实验操作步骤如下:1.细胞准备:A.细胞状态检测:从培养箱中取出细胞,显微镜下观察。状态描述:观察结果,细胞汇合度:B.细胞处理:将细胞培养基吸出后,加入2mlPBS缓冲液洗一次,加入1ml0.25%Trypsin-EDTA,放入培养箱中静置数分钟,直至细胞完全离壁悬浮,加入5ml含10%FBS的培养基(无抗生素)终止酶活,混匀后液体转移至15ml离心管,1000rpm离心3min,弃去液体。C.细胞计数:于15ml离心管中
2、加入1ml含10%FBS的培养基(无抗生素),充分混匀。取40ul计数,公式如下:细胞浓度(数/ml)=(4大方格细胞数之和/4)×104×稀释倍数最终得到的细胞密度填入下表,根据最终需要细胞浓度及体积进行稀释。细胞数/孔起始浓度(/ml)所需体积(ml)需20%FBSDMEM(ml)总体积终浓度(/ml)细胞株名D.稀释细胞2.将稀释好的细胞用排枪加至96/384孔板:置于培养箱37℃5%CO2条件下培养24小时,待细胞贴壁后加药。3.药物稀释:将药物进行3倍倍比稀释。1.将稀释好的药物加入前一天铺好细胞的细胞板上,37℃5%CO2培养箱培养72h。2.荧光素酶检测:将Celltiter
3、-Glo与ddH20以1:1混合,加入细胞板(96板:20ul/well;384板:10ul/well),静置10min后,TECANinfiniteF200酶标仪读值。3.分析数据,绘制IC50曲线,寻找IC30,IC50等值。4.验证IC50:根据IC50曲线找出IC50理论值,分别取1/2倍、1倍及2倍的理论值进行药物浓度验证。附录:MaterialsforExperimentNameCorporation96-wellplateCorning384-wellplateGreinerCentrifugeTube(15ml)BDFalconPipets(10ml)GreinerT-25
4、FlaskCorningTips,EPTubeAxygen,MatrixReagentsforExperimentNameCorporationFBSExcellDPBSHyclone0.25%Trypsin-EDTAGIBCOMediumHycloneCell-TiterGlo™PromegaInstrumentsforExperimentNameModelCorporationInvertedMicroscopeTS100NikonCO2IncubatorBB16UVHeraeusBechtopZHJH-1109ZHCHENGCentrifuge5200KUBOTAMicroplate
5、ReaderinfiniteF200TECANDispenserμFillBio-Tek
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