总蛋白含量测定操作规程

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1、总蛋白含量测定操作规程1目的确保口蹄疫灭活疫苗总蛋白含量测定（lowry）操作规程2范围适用于口蹄疫灭活疫苗总蛋白量测定。3责任部门QC部相关检验人员4内容4.1准备4.1.1设备 酶标仪(全波长)，“M”型96孔板，卡介苗注射器，单通道和多通道移液器，涡旋震荡仪，酶标板振荡器等。4.1.2试剂 丙酮(分析纯)、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒4.2操作步骤4.2.1标准系列稀释液制备 将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白(2mg/ml母液)，按下表依次稀释。编号123456789母液(μl)052550100150200300400去离子水(μl)4003953753

2、503002502001000终浓度(μg/ml)0251252505007501000150020004.2.2检验疫苗处理 取1瓶疫苗（不少于100ml）恢复至室温摇匀后，在3个1.5ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4℃条件下，以15000g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400μl丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50μl去离子水复溶备用。4.2.3反应板加样与读数4.2.3.1各取2.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40μl，以及三重复待检疫苗样品40μl，分别加入到96孔板内。用排枪迅速加入200μl改良lo

3、wry法试剂盒内试剂，立即用振荡器混匀30秒;4.2.3.2封膜，室温孵育10分钟;4.2.3.3各孔内分别加入20μl1倍酚试剂(试剂盒内为2倍，用前用去离子水现稀释)，立即用振荡器混匀30秒;4.2.3.4封膜，室温孵育30分钟;4.2.3.5酶标仪测定750nm吸光值，保存读数。4.2.4数据处理根据系列标准蛋白稀释液的浓度(0μg/ml~2000μg/ml)和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值为X轴，以蛋白标准浓度为Y轴，绘制标准曲线，依据趋势线求得多项式，其多项式≥0.98。将被检样品的吸光值代入标准蛋白获得的多项式，计算样品中蛋白含量，根据取样量求得1ml样

4、品中蛋白含量。例如口蹄疫灭活疫苗水相/油相比例为1:1，免疫剂量为2ml时，100μl疫苗经丙酮沉淀后用50μl去离子水复溶，测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度，或2ml疫苗中蛋白浓度。结果判定时，将测定值除以2即得每毫升疫苗中总蛋白含量。4.2.5结果判定若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500μg，则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500μg，判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。4.2.6检测数据处理举例4.2.6.1收集数据如表所示Value123456789101112A0.1020.1490.3360.5040.8361.12

5、21.3341.7021.923------B0.6771.7220.2521.1162.1671.020------------C0.6401.7040.2301.0502.1950.962------------D0.6411.7160.2251.0612.1751.012------------E------------------------F------------------------G------------------------H------------------------上述表格中，A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白浓度依次增

6、高;B、C、D行中1-6列为检测样品750nm吸光值，B1-B6为6批不同批次疫苗样品，每一列为同一疫苗样品三个重复。4.2.6.2绘制标准曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中，Value123456789OD7500.1020.1490.3360.5040.8361.1221.3341.7021.923蛋白浓度μg/ml025125250500750100015002000采用EXCEL程序，选中1-9列对应的两行数据→"插入"→"散点图"，选择"带平滑线和数据标记的散点图"，得到以750nm吸光值为X轴，以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择"图表工具"中"布局"→"趋势线

7、"→"其他趋势线选项"，选中"多项式"、"显示公式"和"显示R平方值"。通常R平方值大于等于0.98表明标准曲线可信。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。4.2.6.3数值计算以样品测定OD750值为X，代入y=411.69+220.65x-3.9423，Y为蛋白浓度，以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定的OD750数据(X)分别为:0.677、0.640、0.641，代入公式计算蛋白含量(Y)分别为:334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，该数据为每毫升水相抗原中总蛋