DB21T 2341-2014 马铃薯种薯（种苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程

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1、ICS65.020.01B05DB21辽宁省地方标准DB21/T2341—2014马铃薯种薯（种苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程2014-07-05发布2014-09-05实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2341—2014前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由沈阳市农业科学院提出。本标准由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、辽宁省农业科学院、铁岭市农产品质量安全检验检测中心。本标准主要起草人：杨双、潘菊、左丽君、岳玲、王辉、李金凤、马东梅、刘延斌、孙嘉兴、李雪。1DB21/T2341—2014马铃薯种薯（种

2、苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程1范围本标准规定了马铃薯种薯（种苗）的总RNA提取、多重RT-PCR扩增、电泳检测及结果判定的方法和操作规程。本标准适用于马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB18133-2012马铃薯种薯GB/T29377-2012马铃薯脱毒种薯级别与检验规程3术语和定义下列术语及定义适用于本标准。3.1马铃薯Y病毒（potatovirusY，PVY）马铃薯Y病毒(Pota

3、tovirusY,简称PVY)，在马铃薯上引起严重花叶或坏死斑和坏死条斑。PVY是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的主要成员，病毒粒体线形，长730nm，该病毒寄主范围较广，可侵染茄科多种植物。病毒基因组为9.7Kb的单链正义RNA，基因组5′端共价结合基因组连接蛋白（VPg），3′端含有PloyA尾巴，该基因组为一个长的开放读码框（ORF），可翻译成一个多聚蛋白，随后切割产生8~10个产物。3.2马铃薯A病毒（potatovirusA，PVA）马铃薯A病毒(PotatovirusA,简称PVA)，在马铃薯上引起轻花叶或不显症。PVA是马铃薯Y病毒属（Potyv

4、irus）成员，病毒粒体线形，长730nm，其寄主范围较窄，仅侵染茄科少数植物。病毒基因组为近1Kb的单链正义RNA，基因组5′端共价结合基因组连接蛋白（VPg），3′端含有PloyA尾巴，该基因组包含一个开放读码框（ORF），可翻译成一个多聚蛋白，随后切割产生11个产物。3.3DEPC水（DEPC-TreatedWater）2DB21/T2341—2014DEPC是焦碳酸二乙酯,分子式为C6H10O5，分子量为162.14，通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，常用于生物实验中RNA的提取等。DEPC水指经过是指用DEPC处理过

5、并经高温高压消毒的纯水。3.4反转录-聚合酶链式反应RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，实现扩增RNA上特异片段的技术。3.5cDNA互补DNA，指与单链RNA互补的DNA，此为单链cDNA分子，或以此单链DNA为模板合成另一条与其互补的单链DNA,两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子。4原理本标准涉及的马铃薯Y病毒（PVY）和马铃薯A病毒（PVA）属于单链正义RNA病毒，在宿主内以RNA形式存在，通过提取

6、待测植物组织总RNA,利用2对引物的多重RT-PCR方法扩增2种病毒的特异序列，通过琼脂糖电泳检测目标条带的有无，确定是否感染相应病毒。5仪器设备及试剂5.1仪器设备PCR仪；水平电泳槽；电泳仪；万分之一电子天平；微量加样器；恒温水浴锅；磁力搅拌器；高速冷冻离心机；紫外-可见成像系统；高压灭菌锅；pH计等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；硼酸；盐酸（HCl，36%）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；氯化锂溶液（LiCl，10mol/L，RNase-free）；氢氧化钠（NaOH）；ß-巯基乙醇；无水

7、乙醇；M-MLVReverseTranscriptase（200units/μL）；Oligo（dT）15（10μmol/L）；（dN）9（10μmol/μL）；dNTPs（10mmol/L）；RNaseinhibitor（40units/μL）；二硫苏糖醇（100mM）；2×TaqPCRMix(withDye)；引物；DEPC水；琼脂糖；GoldView染料等。5.3溶液配制相关溶液配制方法见附录A。6方法步骤6.1抽样按照GB/T29377-2012的规定进行抽样。3DB21/T2341—20146.2总RNA提取6.2.1组织裂解将少量样品（植物叶片、块茎