《尼克酰胺NA在细胞》PPT课件

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1、尼克酰胺（NA）在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用RoleofNicotianamineintheIntracellularDeliveryofMetalsandPlantReproductiveDevelopmentMichikoTakahashi，YasukoTerada，IzumiNakaiLaboratoryofPlantBiotechnology,UniversityofTokyo,JapanDepartmentofAppliedChemistry,ScienceUniversityofTokyo,J

2、apanThePlantCell,Vol.15,1263–1280,June20041Introduction2Methods3Results4Discussion1Introduction1尼克酰胺（Nicotianamine，NA），是一种金属螯合剂，普遍存在于高等植物中，NA可螯合金属阳离子。研究认为NA在植物体内Fe和其他金属的运输过程中起作用。NA也可能与Fe（Ⅲ）作用保护细胞免受氧化胁迫的伤害。但是，在高等植物中NA准确的作用仍不清楚。2尼克酰胺氨基转移酶（Nicotianamineaminotransf

3、erase，NAAT）催化NA的氨基转变，在禾本科植物中，NAAT是获得Fe所必需的。NAAT为禾本科植物所特有。3麦根酸类植物高铁载体（Mugineicacidfamilyphytosiderophores，MAs），由禾本科植物根系分泌，它是一类低分子量的非蛋白氨基酸，可溶解土壤中的Fe，是天然的Fe螯合肽。NAAT是MAs合成过程中的关键酶(Fig1)，催化NA的氨基化，是MAs生成过程中的一个基本媒介，MAs只有在禾本科植物中产生。注：在缺铁胁迫下，禾本科植物根系分泌出MAs，活化土壤中难溶的三价铁化合物，然

4、后在专一的转运蛋白的作用下将Fe3+-MAs转运进胞质中，从而被植物利用。4MAs的生物合成途径为了研究非禾本科植物中NAAT产生异常的原因，把包含花椰菜病毒的35S启动子与hvnaat-A基因编码区结合的载体转入烟草（产生NA但是不产生植物铁载体），表达NAAT基因的转基因烟草植物（naat烟草）的幼叶有网纹状失绿症，花的形状异常且不育，naat烟草可产生大量的NAAT，从而使得NA短缺。本文描述转基因烟草表达大麦NAAT基因和在植物中NA消耗的表型，并试探就NA在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用。2Meth

5、ods1二元载体构建：缺铁大麦根部中分离hvnaat-AcDNA—在pUC118菌株SmaI位点克隆—pUC118-hvnaat-A用XbaI和SacI进行融合—克隆在pIG121Hm菌株中。2植物材料和生长条件：1）通过三亲株交配—二元载体pIG121Hm-hvnaat-A被引入到根瘤农杆菌株C-58—烟草中进行转化和再生—离体烟草腋芽T0嫁接到nas烟草上——收获naat烟草T1的种子—在nas烟草上继续嫁接获得T2。2）Naat烟草（T2），nas烟草，野生型烟草和对照烟草生长在装有蛭石的盆里，条件为25C(d

6、ay/night)，自然光照，每天用稀释1000倍的Hyponex营养液浇灌植物，培养后作为实验材料。注：Nas烟草也是转基因植物，是使用具有花椰菜病毒35S启动子-hvnas1基因插入pBIGRZ1菌株转化而成，并被证明超表达NAS（nicotianaminesynthase）基因。3DNA凝胶电泳分析：DNA的提取—分离—电泳—扩增—杂交—拍照4RNA凝胶电泳分析：RNA的提取—变性—电泳—扩增—杂交—拍照5尼克酰胺氨基转氨酶（NAAT）的分析：用HPLC分析6叶片的显微结构和超微结构观察：环氧树脂切片法7金属浓

7、度的测定：发射光谱仪测定8金属在叶片中的分布：同步加速器诱导辐射X-射线荧光光谱仪（XRF）观察9NA的提取和分析：用HPLC进行定量分析10失绿叶叶绿素的测定：用SPAD-502叶绿素仪测定11花型异常的逆转实验：离体腋芽用五个溶液处理：(1)0µMNA+20µM柠檬酸Fe(III)；(2)20µMNA+20µMFeCl3，(3)20µMNA+20µMFeSO4，(4)20µMNA+20µM柠檬酸Fe(III)，(5)100µMNA+20µM柠檬酸Fe(III)12Naat烟草在nas烟草上的嫁接：以nas烟草为砧

8、木，去除叶子，把naat烟草嫁接于上(Figure9A)。进行两次嫁接试验以获得足量的种子。最后，再嫁接离体烟草（T2naat烟草）进行分析。3Results1大麦naat-A基因在烟草中的整合及其表达2转基因烟草（naat烟草）的表型具失绿症幼叶失绿症是植物金属缺乏的普遍症状。因此，作者通过电感耦合等离子发射光谱仪测定了naat烟草和对照叶片