《基因工程概述》PPT课件

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1、（feiyun39@126.com)基因工程首都师范大生命科学学院祁晓廷（qixiaoting@cnu.edu.cn;qxt-163@163.com）现代生物技术是解决人类面临的困境的有效途径基因工程的地位发酵工程细胞工程酶工程蛋白质工程基因工程常用生物技术举例干细胞技术：恩同再造，无论换器官还是重生。基因治疗：遗传物质的局部改变，亟待提高安全性。哺乳动物体细胞克隆技术：开启了一个人类无法预知的克隆人的大门，是福是祸？全基因组测序：遗传天书编排才开始，读懂它尚需时日。单克隆抗体技术：细胞全能性和细胞融合技术的完美结合。………………….干细胞技术基因治疗技术1997年多利羊诞生使体细胞克隆

2、哺乳动物成为可能多利和它的孩子人类基因组计划--人类基因的破解基因工程----现代生物学技术的核心，是基因乾坤大转移和大融合的技术基因工程应用微生物发酵：制备工业原料、食品添加剂等农业生产：动植物营养品质改良，提高抗逆性医药业：基因工程制药（抗生素、疫苗、抗体等）军事：生物武器航天：提高生物耐缺氧、耐辐射等性状。植物基因工程ACC合成酶利用反义RNA技术，抑制乙烯合成的前体耐贮运对于番茄、草莓、香蕉、苹果等果蔬最为重要这些东西最好也不要出现！微生物基因工程转基因植物番茄子叶分化转基因番茄的移栽田间生长与结实ELISA检测转基因植株HBsAg活性转基因番茄的PCR鉴定乙型肝炎表面抗原在转基

3、因番茄中的表达体细胞核移植制备转基因动物的基本过程胚胎干细胞的筛选和细胞移植培育转基因动物的基本过程转基因动物工具酶的总结克隆载体载体（Vector）的概念添加复制起始位点、启动子和转录终止子可以解决“单独”的外源基因在宿主细胞内不能复制表达甚至被降解的“杯具”。这一需求催生了--载体。载体是携带外源基因在宿主细胞内完成的复制甚至表达人工构建的DNA分子。载体的分类根据用途可以分为：克隆载体：在宿主细胞内高保真地大规模复制。测序载体：用于测定DNA序列。表达载体：用于外源基因的表达。尽管如此，“三合一”的载体目前经常用。根据来源不同可以分为：质粒载体，病毒载体，人工染色体载体的基本条件1

4、、能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。2、具有合适的多种限制酶的单一切点。3、具有适宜的筛选标记。4、相对分子质量小，细胞内拷贝数要多。5、在细胞内稳定性高，易分离纯化。载体结构多克隆位点，容许外源基因插入的合法位点宿主细胞能识别的复制起始序列，如果含有两种以上复制起始位点，则为穿梭载体筛选标记：抗生素分解基因（Amp,Km等）、报告基因（GUS,GFP,LUC,LacZ）。这些基因多为组成型启动子控制，恒定表达。启动子（宿主细胞能识别的启动子）终止子（转录终止序列，多来自宿主细胞病毒和细菌）体外重组重组DNA向宿主细胞导入RecombinantDNA重组重组是通过T4DNA连接酶

5、将目的DNA片段插入到载体相应位点的DNA重组过程。通过优化连接参数可以获得高的连接效果。具体如下：1.插入片段摩尔数要多于载体摩尔数（3-10倍）；2.平末端连接采用低温（4-8度过夜），而黏性末端在室温下连接几小时或16度连接过夜。3.连接体系一般为10-20微升，体积过大过小会影响连接效率。4.可以用T4RNA连接酶连接单链的DNA分子。体外重组线路图导入重组体主要方法物理学方法：微注射技术、基因枪技术、电转化法（电穿孔术）、超声波化学方法：CaCl2低渗转化大肠杆菌、脂质体介导法、PEG介导生物媒介方法：病毒介导法、农杆菌介导转基因方法转化原理负对照实验组正对照蓝白筛选结果根癌农

6、杆菌介导转化植物的方法1.根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)的一般性质：冠瘿病Ti质粒（Tumorinducingplasmid)T-DNA(TramsferredDNA)区Vir区*冠瘿瘤的特点：激素自主性冠瘿碱幻灯片5无正常分化能力*农杆菌与Ti－质粒的类型：章鱼碱型（octopinetype）胭脂碱型（nopalinetype）农杆碱型（agropinetype）*冠瘿碱可以分为四类：章鱼碱族胭脂碱族甘露碱族农杆素OctopineVir基因的基本结构与功能A:a.中间载体必须有T-DNA的同源序列，还有pBR的序列，进入农杆菌后高频同源重组b.要有细菌选

7、择标记基因，便于筛选共整合质粒c.阳性的这选择标记基因d.单一的限制内切酶切点，多克隆位点e.无Ti质粒的边界序列f.要有bom位点序列，可以在不同细菌细胞间转移B.二元载体系统的中间载体特点：a.无同源序列b.有LB和RBc.无cellEI复制点T-DNA的整个转化过程缺失启动子-GUS表达载体转化烟草对照抗性芽（Km:100ug/ml）生根的转基因烟草苗（Km:100ug/ml）转化烟草土培苗开花的土培苗电转化法（electro