pcr技术发展与展望

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1、PCR技术的发展及展望摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来．基于常规PCR技术开发出了许多新的用途。综述了PCR技术的主要扩展。关键词：PCR技术1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow

2、片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能

3、扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断[1]。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。1.PCR技术的扩展1.1AP-PCR技术1.1.1AP-PCR技术的定义、来源及特点AP-PCR(ArbitrarilyprimedPCR)技术[2]，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下．主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增l至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图,即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR技术由Williams等[3]于20世纪90年代建立．它可以快速地从两个或更多的个体组

4、织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。1.1.2AP-PCR技术的应用AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离，Liang和Pardee[2]应用AP-PCR技术对正常A31和肿瘤起源的BPA31细胞进行了鉴定，并分离得到了仅存在于正常细胞的N1及仅存在于肿瘤细胞的T1片段；(2)菌株鉴定，杨国玲等[3]采用AP-PCR技术对甲真菌病病原菌进行了快速鉴定；(3)遗传作图，Welsh等[2]成功地应用AP-PCR方法快速鉴定了重组鼠(C56BL/6J×DBA/2J)扩增多态性在染色体图谱中位置。1.2L

5、P-PCR和彩色PCR1.2.1LP-PCR和彩色PCR的定义LP—PCR(LabelledprimersPCR)．即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，通过PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。彩色PCR(ColorComplementAssay)是指利用荧光染料标记引物的5’端，不同荧光(荧光染料TAMRA呈红色荧光，JOE和FAM呈绿色荧光,COUM呈蓝色荧光)标记的引物同时参加反应,经PCR反应扩增后，根据不同荧光的色泽来判断目标基因是否存在及扩增基因的类型[4]。1.2.2LP-PCR和彩色PCR的比较LP-PCR与彩色PCR由荧光PCR[5]那发展

6、而来，彩色PCR是LP-PCR的一种。与常规PCR相比，LP-PCR更为直观,其省去了限制性内切酶酶解及分子杂交等繁琐步骤，并且一次可以同时分析多种基因成分，但是LP-PCR只能对产物进行定性鉴定。与LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2种不同颜色的引物：一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照。但是在检测多点突变时，彩色PCR需用更多的色彩[4]。1.2.3LP-PCR和彩色PCR的应用LP-PCR和彩色PCR是常规PCR技术与标记技术相结合的产物，LP-PCR常被用于大量临床标本的基因诊断，同时可用于对PCR产物进行定性鉴定。彩色PCR常被用予检测基因的突变，染色体重排或转位，基

7、因缺失及微生物的型别鉴定等，如被用于检测多突变点的遗传病[4]。1.3免疫PCR技术1.3.1免疫PCR技术的定义、来源及特点免疫PCR(immunopolymerasechainreaction，IM-PCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，它综合了同相免疫反应和PCR的特点。免疫PCR技术是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术[6]。与常