《动物基因工程》课件

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1、第十一章动物基因工程www.haust.edu.cn1第一节基因工程概述理论上的三大发现DNA为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实验DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制遗传密码与中心法则www.haust.edu.cn2技术上的三大发明1.限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机”2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等3.逆转录酶：从mRNA到DNA，使真核基因制备成为可能www.haust.edu.cn3www.haust.edu.cn4www.haust.edu.cn5www.haust.e

2、du.cn6www.haust.edu.cn7www.haust.edu.cn8www.haust.edu.cn9www.haust.edu.cn10www.haust.edu.cn113、基因工程的内容目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离www.haust.edu.cn12基因操作中的工具酶手术刀－限制性核酸内切酶、核酸外切酶缝纫机－连接酶复印机－DNA聚合酶、逆转录酶第二节基因操作中的工具酶www.haust.edu.cn13一、限制性内切酶的概述（

3、一）概念限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列的有300种以上。www.haust.edu.cn14（二）限制性内切酶命名规则限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。如EcoRI来源于Echerichia.coliRY13Ba

4、mHI来源于B.amyloliquefacienswww.haust.edu.cn15HindIIHaemophilus(属名)Influenzae(种名)d(株系)罗马数字限制性内切酶命名举例www.haust.edu.cn16类别反应必须因子专一性活性I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+识别部位和切点不同，无特定切割位点内切甲基化II型Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位只有限制酶活性III型ATP，Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位内切甲基化（三）限制性内切酶分类www.haust.edu.cn17www

5、.haust.edu.cn18（四）II型限制性内切酶的特性（1）II型限制酶的识别特异性回文识别序列II型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构,或称回文序列(PalindromicSequence)www.haust.edu.cn19（2）识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4－8个核苷酸且呈二重对称。（3）具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。www.haust.edu.cn20识别序列(位点)双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列被识别的碱基序列

6、通常具有双轴对称性，即回文序列(PalindromicSequence)。EcoRI的识别序列www.haust.edu.cn21二、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶(DNAPolymerase)的基本特性能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从膜版上的解离作用。DNA-OHDNA-(pdN)n＋nPPidATP，dTTP，dCTP，dGTP，Mg2＋DNA聚合酶www.haust.edu.cn22大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性①5‘-

7、-3’DNA聚合酶活性。②5‘--3’外切核酸酶活性。③3'--5'外切酶活性。www.haust.edu.cn232．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途①利用E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5‘--3’外切核酸酶活性，可用切口平移法（nicktranslation）标记DNA，所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应。②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性。但由于具有5‘--3’外切活性，现在已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶（详见后面）。③对3‘突出端的DNA作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用T4或T

8、7DNA聚合酶效果会更好。www.haust.edu.cn24（二）KlenowDNA聚合酶无5’→3’外切活性有聚合活性有3’→5’外切活性由于没有5'--3'外切活性，使用范围进一步扩大www.haust.edu.cn25KlenowDNA聚合酶用途①补平3’凹端DNA。②抹平DNA3’凸端。③通过