从互作揭开lncRNA的秘密

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1、从互作揭开lncRNA的秘密近年来，长非编码RNA（lncRNA）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncRNA，但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。RIPRNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP（RNAimmunoprecipitation），可以说是RNA版的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。在RIP试剂盒（如Sigma的Imprint®RNAImmunoprecipitationkit）的帮助下，研究者们能够利用

2、针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。不论是细胞质还是细胞核，都会发生RNA与蛋白的相互作用。据ActiveMotif公司产品经理KyleHondorp介绍，该公司的RNAChIP-IT®kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用DNAseI处理，最后利用磁珠进行沉淀。“如你研究的是总mRNA，那么常规RIP试剂盒更合适一些，”Hondorp说，“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”生产M

3、agnaRIP™RNA-bindingproteinimmunoprecipitationkit的EMDMillipore公司，也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布，该产品有化学交联与native两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。除RIP以外，CLIP（UVcrosslinkingandimmunoprecipitation）也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化，不仅

4、允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP技术——iCLIP（individual-nucleotideresolutionCLIP），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息。据伦敦大学学院的JernejUle教授介绍，CLIP与RIP的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记，并将这些复合物进行SDS-PAGE分离，之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的RNA

5、。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来，用于制备cDNA文库，以备测序分析。“CLIP要比RIP麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”Ule说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高cDNA文库的质量，最终得到准确实用的数据。”ChIRP、CHART和RAP如果你对某种RNA感兴趣，希望研究与其发生相互作用的蛋白，就需要采用新的实验方案。ChIRP（chromatinisolationbyRNApurification）、CHART（capturehybridizationanalysisofRNAtargets）和RAP（RNAantisensepurifica

6、tion）都基于同样的理念，将与目标RNA互补的寡核苷酸进行生物素标记，并由此捕获相关蛋白。之后研究者可以通过二代测序或质谱分析，来鉴定与RNA互作的蛋白，明确发生这些互作的基因组区域。据NEB的G.BrettRobb介绍，上述三种方法解决了当今RNA生物学中的关键需求。目前，研究者们已经鉴定了大量的lncRNA，但却不清楚它们的功能。“解决这一问题的途径之一，就是寻找与这些RNA发生互作的蛋白。”举例来说，加州理工学院的MitchellGuttman和宾州大学的JeannieLee，就分别在使用RAP和CHART对XistlncRNA展开研究。据悉，目前ChIRP、

7、CHART和RAP技术都还没有商业化。不过有一个试剂盒可以实现从已知RNA分离蛋白，即MBLInternational的RiboTrap系统，该系统能够利用体外转录的RNA（带生物素标记），从细胞提取物中分离与之结合的蛋白。让互作变的清晰可见在体外确定了自己感兴趣的RNA-蛋白互作之后，我们可以通过体内实验进行验证。这时，Sigma公司的DuoLink®proximity-ligationassay就派上了用场。Sigma公司的AaronSin介绍道，DuoLink系列原本用于研究蛋白质之间的相互作用。这一系统包括两种标记了寡核苷酸的抗体，这些抗体分