《ELISA介绍》PPT课件

《《ELISA介绍》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、ELISA知识简介刘丽萍1.ELISA的原理2.ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），是在1971年建立的一种测定方法，称为酶联免疫吸附测定.1.ELISA的原理ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面（免疫吸附剂），可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物（结合物），而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可

2、根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。ELISA的应用ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定

3、，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。2ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可设计出各种不同类型的检测方法。双抗体夹心法测抗原双抗原夹心法测抗体间接法测抗体竞争法测抗体、测抗原捕获包被法测抗体2.2.1双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原（二价或二价以上

4、），例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。2.2.2双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3间接法测抗体是检测抗体常用的方法，间接法首先用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或者至少是极微小的颗粒。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。主要用于对于病

5、原体抗体的检测而进行传染病的诊断。2.2.4竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体越少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。2.2.5竞争法测抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物

6、之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。2.2.6捕获包被法测IgM抗体IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如果抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检测中测定IgM抗体时多采用捕获包被法，用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM

7、抗体和非特异性的IgM），然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。2.2.6捕获包被法测IgM抗体3.ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液ELIS