Westerblot 试验操作步骤

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1、Westerblot试验操作步骤一、蛋白样品制备WIP组织细胞裂解液（塞池）取出WIP裂解液，待融化后颠倒混匀数次，适量分装冻存。在使用前取出PMSF（100mM），按比例加入（使其最终浓度为1mM）混匀，立即使用。取Ep管，分别称重标记，把组织剪成小块装入Ep管中，称重。按每20毫克组织家100—100微升的比例加入WIP（如裂解不完全，可以适当增加WIP的用量；如需要的蛋白样品浓度较高，可以适当减少WIP的用量）。用手握式电动组织细胞匀浆器匀浆约1分钟或直至充分裂解。10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、

2、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。如果组织样品本本身非常细小，如淋巴细胞，可直接加入WIP裂解液，通过震荡（vortex）以使样品裂解完全。注意事项：(1)为获得最佳的实验效果，可适当分装使用，以尽量避免反复动融。(2)PMSF应现用现加(3)裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。(4)蛋白酶抑制剂均有较高的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，一旦直接接触，请立即用流水冲洗，再向医疗保健结构咨询。二、蛋白浓度测定：采用BCA法。（WIP裂解液中含有较高浓度的TritonX-100等干扰物质，不能用Bradfor

3、d法进行蛋白定量。）三、SDS-PAGE的配制：分离胶12%，浓缩胶5%1试剂及配制：（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g；去离子水至100ml；过滤，避光，4℃贮存1个月。（有毒）（2）1.5mmol/LTris溶液（PH8.8）：Tris碱18.15g→80ml去离子水→浓盐酸调节PH至8.8→去离子水至100ml；4℃贮存。（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）Tris碱12.1g→80ml去离子水→浓盐酸调节PH至8.8→去离子水至100ml；4℃贮存。（4）10%SDS:10gSDS→100

4、ml去离子水；室温贮存。（5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵→1ml水。4℃可保存1周，最好用前现配。（6）TEMED（7）分离胶、浓缩胶液配方：12%分离胶5%浓缩胶10%分离胶5ml10ml2ml4ml5ml10ml水(ml)1.63.31.42.72.04.030%丙烯酰胺(ml)2.04.00.330.671.73.31.5mmol/LTris溶液(pH8.8)(ml)1.32.5——1.32.51.0mmol/LTris溶液(pH6.8)(ml)——0.250.5——10%SDS(ml)0.050.10.020.040.050

5、.110%过硫酸铵溶液(ml)（催凝剂）0.050.10.020.040.050.1TEMED(ml)0.0020.0040.0020.0040.0020.0042.制胶程序：（小分子量）（1）装板（1）配制分离胶（按5ml/胶的量混合）；加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约1cm，约需4ml/胶）（2）立即在顶层加入几毫升覆盖液（凝胶浓度＜8%用0.1%SDS;＞10%用正丁醇；也可用去离子水；动作要轻，尽量避免覆盖液稀释分离胶顶部）。（3）聚合完成后（约15min），倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上

6、部数次，尽可能洗干凝胶顶端的残存液体。用力把水甩干。（4）配制浓缩胶（每块胶的用量是2ml），插入梳子，避免混入气泡，垂直放置于室温下聚合。（5）在浓缩胶聚合后，拔出梳子，用去离子水冲洗梳孔，直接电泳或放4℃冰箱备用（注意：勿使胶干燥，可用保鲜膜包裹）。（6）分离胶、浓缩胶的配方Tricine-甘油SDS-PAGE分离胶夹层胶浓缩胶16.5%4.5ml10%2ml4%2ml49.5%T3%C/0.407ml0.160ml49.5%T6%C1.50ml//凝胶缓冲液1.4ml0.623ml0.463ml4.5％SDS0.1ml0.044ml0.

7、033ml甘油0.48ml//ddH2O1.02ml0.926ml1.344ml10％AP40μl20μl20μlTEMED5μl3μl3μl（先制备分离胶，聚合后，再制备夹层胶，最后制备浓缩胶，分离胶2.5ml，夹层胶0.7ml，浓缩胶1.25ml。）四、电泳：1试剂：（1）上样缓冲液（5×）：上样Buffer用时稀释5倍（即用时取1ml+4ml去离子水）（2）电泳缓冲液（5×）：试剂用量用量甘氨酸47g94gTris碱7.55g15.1gSDS2.5g5g水500ml1000ml（3）预染蛋白分子量Marker2电泳程序：（1）样品与加样

8、缓冲液混匀（稀释成1×，100℃3—5min，充分变性）（2）将凝胶放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液（内加150ml加满，用新配的；外加350ml，可重复用2—3次