SDSPAGE凝胶电泳nWesternbl

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1、SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot检测技术SDS-PAGE凝胶电泳实验原理实验步骤注意事项电印迹SDS-PAGE的优点SDS-PAGE的缺点实验常见问题及处理小技巧实验原理背景基本原理分类分离范围实验中各成分作用背景1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.丙烯酰胺N,N’-亚甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺四甲基乙二胺(TEME

2、D)过硫酸胺(AP)激活作用激活作用共聚合基本原理之一阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。强还原剂巯基乙醇（现在常用二巯基苏糖醇，DTT）打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。基本原理之二结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移

3、率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。分类PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类.连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。电泳槽不连续系统不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。浓缩胶浓缩胶的作用是有堆积作

4、用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。浓缩胶电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附

5、近，浓缩成一中间层。Gly-Pro-Cl--+分离胶孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子量不同,通过分离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白的分子量不同而分开.Pro1-Pro2Gly-Cl--+积层胶分离胶凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形

6、成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。浓缩效应电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快

7、离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。分离胶内的电荷效应与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物

8、都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。但在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位（注意SDS结合蛋白质的前提条件是有还原剂DT