marfey法与质谱联用技术

《marfey法与质谱联用技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、Marfey法与质谱联用技术及其应用目录前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理1.Marfey法分离机制的探讨2.Marfey法与质谱的联用3.衍生化过程小结应用举例前言常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种：（1）化学转变法；（2）旋光比较法；（3）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（CD）；（4）单晶X－射线衍射法；（5）核磁共振法；（6）Marfey法与质谱联用。目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法，确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。另一方面，色谱方法例如GC和HPLC已经代

2、替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。1984年，Marfey发明了一种用HPLC来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将D-和L-氨基酸用HPLC分离成对映异构体。于是引入手性试剂FDAA（（1-氟-2，4-二硝基苯基-5）-L-丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)

3、-L-alaninamide），被命名为Marfey试剂。氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离，并在UV340nm处进行检测。L-氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度。因此，Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用。但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。常见的Marfey试剂如下所示：L-FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺L-FDVA:……………..…

4、…………..-L-缬氨酰胺L-FDPA:……………..……………..-L-苯丙氨酰胺L-FDIA:……………..……………..-L-异亮氨酰胺L-FDLA:……………..……………..-L-亮氨酰胺D-FDAA:……………..……………..-D-丙氨酰胺其结构如下：为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起来，必须解决如下三个问题：（1）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制，及其局限。（2）如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目标氨基酸。（3）如何从一个肽类样品的L-或D-氨基酸中获得相应的对映异构体LC/MS决定氨基酸绝

5、对构型的原理Marfey法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用衍生化过程Marfey法分离机制的探讨下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全过程，命名作“高级Marfey法”如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部分（sample1和sample2)。Sample1与FDAA衍生化后，直接用LC/MS分析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。Sample2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构型。由于天然存在的肽类往往由D-型或L-型氨基酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，其

6、绝对构型无法在这一步决定。因此，为了得到其对映体，Sample2中的氨基酸必须在适当的条件下进行外消旋化。但是，与FDAA衍生化及外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现一对差向异构体。在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择到这两个峰。然后，通过比较Sample1中原峰的保留时间和Sample2中新产生峰的保留时间，就可以根据Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。本法将可购得的氨基酸分为四类：中性氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和N-甲基氨基酸，在同样的条件下研究其分离行为

7、。FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括N-甲基反应。每种氨基酸的非对映异构体对都是通过其D-异构体的保留时间(tRD)和L-异构体的保留时间(tRL)的差值(△t)来判定的。当△t值大于±1.0时，每组非对映异构体对完全被分离为两个非对映异构体。左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异。对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物，因为FDAA会引入到－NH2上，也会引入到酚－OH上。酸性或含－OH氨基酸的判