酶学与酶工程第六章酶的固定化

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1、第六章酶、细胞、原生质体的固定化一、固定化酶（ImmobilizedEnzyme）1.定义：固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使之成为不溶于水的，但是仍具有生物活性的酶。催化反应后的酶可以回收重复使用。第一节酶的固定化固定化酶优点：极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺；可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应，酶的使用效率提高，成本降低；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；较游离酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量。。固定化酶的缺点：

2、由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损失；由于固定化需用载体，因而多了载体成本费及固定化操作费用；固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降；只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适宜。必须注意维持酶的催化活性及专一性应该有利于生产自动化、连续化应有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利于反复使用固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或反应液发生化学反应固定化酶成本要低，以利于工业使用二、固定化酶的制备原则酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性的载体

3、结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化方法有很多，但对任何酶都适用的方法是没有的，必须经过试验研究才能确定。酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法。三、固定化方法1.吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易

4、脱落，2.包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法）将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包埋法；将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因此可以应用于许多酶、微生物的固定化。1）凝胶包埋法凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法主要用包埋载体：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶，聚丙烯酰胺凝胶2）微胶囊法微胶囊固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球状体，比凝胶包埋

5、颗粒要小得多，底物和产物扩散阻力较小，但是反应条件要求高，制备成本也高。界面沉淀法或称相分离法利用某些聚合物在水相和有机相溶解度极低而形成薄膜将酶包埋。界面聚合法利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶二级乳化法脂质体包埋法由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶3.结合法选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。可分为离子键结合法，共价键结合法两种。1）离子键结合法在适宜的pH和离子强度条件下，酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法，因而也称离子

6、交换吸附法。离子结合法的优点是：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺点是：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。2)共价结合法共价结合法是指借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固定化方法。载体有：天然高分子衍生物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龙等酶和载体的偶联反

7、应有多种，取决于载体上的功能基团与酶分子上的非必需侧链基团。载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团间不具有直接反应的能力，所以要通过两类方法来解决：一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。重氮反应是带芳香氨基的水不溶性载体的主要反应，载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基直接进行偶联溴化氰法：对于带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等来说，这是最常用的反应。芳香

8、烃化反应：含羟基的载体也可在碱性条件下和三氯均三嗪等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚基或巯基等偶联。叠氮反应：适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM—纤维素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯－顺丁烯二酸酐共聚物等。共价结合法的优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，这有利于连续使用缺点：该方法反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较激烈的反应条件，可能会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏