生物硕士毕业答辩4

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1、脂联素基因去信号肽区原核表达及酶免检测方法研究专业：微生物学学生：孙强导师：王云龙教授主要内容研究背景目的及意义实验技术路线方法与结果创新与结论研究背景脂肪细胞中发现的唯一与肥胖呈负相关性的特异性血浆蛋白。肥胖、冠心病、Ⅱ型糖尿病患者血浆中的脂联素低于正常水平。编码人脂联素的apMI基因定位于染色体3q27上，长度为16kbp，包含3个外显子和2个内含子。人脂联素由244个氨基酸组成，由分泌信号序列、特异序列、胶原重复序列、球状序列等4个结构域组成，其中球状区(gADPN)是脂联素生物活性的关键部位。脂

2、联素(adiponectin)目的及意义可作为冠心病、糖尿病的辅助诊断依据，并对疾病发生进行有效的预警；可作为评价药物在治疗肥胖、冠心病和糖尿病疾病方面的效果；进一步研究脂联素作用机制提供方便；利用基因工程方法制备脂联素定量检测试剂盒中的标准品，提高了稳定性和生物安全性。本研究建立的血浆脂联素酶免定量检测方法——实验技术路线方法与结果（一）人脂联素基因去信号肽区的克隆与鉴定方法与结果（一）总RNA浓度=OD260×稀释倍数×40μg/mlOD280=0.254，OD260=0.485RNA含量=0.48

3、5×1×40=19.4μg/mL纯度=OD260/OD280=0.485/0.254=1.910人脂肪组织总RNA的提取方法与结果（一）2、PCR扩增目的基因(678bp)M.DNAMarkerDL2000；1.PCRproduct;2.Negativecontrol3、重组质粒酶切鉴定M.DNAmarkerDL2000;1.BamHⅠ+XhoⅠdigestionproductsbpM1220001000750500250100bpM120001000750500250100重组ΔSADPN蛋白的诱导表

4、达及纯化方法与结果（二）方法与结果（二）1、重组菌BL21(DE3)/pET41a/ΔSADPN诱导表达(54.5kD)M..ProteinmoleculeweightMarker;1.Normalcelllysatescontrol;2.celllysatesinducedat25℃for6hours;3.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃for6hours;4.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for6hours;KDM

5、123497.266.444.329.020.1方法与结果（二）2、重组ΔSADPN蛋白活性鉴定3、重组ΔSADPN蛋白诱导表达条件的优化诱导温度的优化M.ProteinmoleculeweightMarker;1～3.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃30℃37℃4～6.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃30℃37℃KDM12345697.266.444.329.020.1诱导时间的优化1～4.Supernatantofc

6、ellllysatesinducedat25℃for(4/6/8/10)hours5～8.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for(4/6/8/10)hours方法与结果（二）12345678诱导剂浓度的优化1～4.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃for(0.10/0.05/0.03/0.02)mol/LIPTG5～8.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for(0.10/0.05/

7、0.03/0.02)mmol/LIPTG方法与结果（二）12345678方法与结果（二）M..ProteinmoleculeweightMarker;1.Sampleofimpurification;2.Elutionproductswith20mmol/LImidazole;3.Elutionproductswith50mmol/LImidazole;4.Elutionproductswith100mmol/LImidazole;5.Elutionproductswith200mmol/LImidaz

8、ole.4、重组ΔSADPN蛋白的纯化KDM1234597.266.444.329.020.1方法与结果（三）双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立方法与结果（三）1、检测标准品的制备2、标准品稳定性试验t=1.112，显著性概率（Sig.）P=0.309＞0.05，表明在2～8℃和37℃放置144h检测结果没有显著性差异，制备的标准品稳定性较好。方法与结果（三）3、包被抗体和检测抗体最佳浓度的选择方法与结果（三）4、检测标准曲线的绘制方法