透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达

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1、!"卷#期微生物学报&’()!".’)#"$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达"2，""22#2""孟春叶勤石贤爱邱荔宋思扬郭养浩（2福州大学生物与食品科学系福州#5$$$"）（"华东理工大学生物反应器国家重点实验室上海"$$"#3）（#厦门大学生命科学学院厦门#%2$$5）摘要：分别用质粒6**%//与6782（/!"#），69*3$"与6:;#"（"!"#），构建大

2、肠杆菌0链霉菌穿梭质粒，将透明颤菌血红蛋白基因转入金色链霉菌。在低溶解氧浓度下，透明颤菌血红蛋白的表达，可提高金色链霉菌氧的利用效率，产物合成比原始菌株提高!$<=%$<。在局部低氧的环境中，采用四环素抗性基因启动子带动血红蛋白基因表达，可有效发挥透明颤菌血红蛋白的氧传递效率，优于透明颤菌血红蛋白基因受溶解氧调控的天然启动子。关键词：透明颤菌血红蛋白基因，金色链霉菌，四环素抗性基因启动子，天然启动子中图分类号：>3?%文献标识码：@文章编号：$$$20%"$/（"$$"）$#0$#$50$%在贫氧环境中，透明颤菌血红蛋白基因（$%&’()*+%,,-A-

3、B’C(’DE,C-,-，!"#）的表达，能促［2］进微生物细胞胞内氧的传输，提高氧的利用效率。在限氧条件下，透明颤菌血红蛋白［"］（&1D）对许多宿主细胞的生长都有明显的促进作用。&1D在大肠杆菌中表达，在贫氧环境中对.)+),%的生长最大促进量可达两倍以上，并能促进工程菌（.)+),%）中青霉素酰化酶及9F.等产物的产量。&1D在限氧条件下对哺乳动物细胞产物生成的促进作用也较［#］明显，能刺激中国仓鼠卵母细胞内促红细胞生成素的产量增加!$<=2$$<。更有意义［!，5］的是，&1D的表达对抗生素生产具有促进作用，在低氧环境下对放线菌紫素的促进作用可达

4、2$倍之多（与同样限氧条件下的参照相比）；限氧条件下对头孢菌素8的产量较参比菌株提高5倍之多。链霉菌发酵过程是一个高耗氧过程，在链霉菌细胞内表达透明颤菌血红蛋白，在溶氧受限的条件下，对菌体生长和产物合成会产生积极的促进作用。本文在金色链霉菌中克隆透明颤菌血红蛋白基因，分别利用透明颤菌血红蛋白基因的天然启动子和四环素抗性基因启动子（G&(&）表达透明颤菌血红蛋白基因。!材料和方法!"!菌株与质粒金色链霉菌菌株（/&’(0&)12+(*-3’()4-+%(5*）为本教研室保存；.)+),%*H2$/购自华美公司；质粒6:;#""、6782/购自华美公司；质粒

5、6:;#"（"!"#）：中国科学院上海生物工程中心"福建省科委资助项目（//010!%）""通讯联系人作者简介：孟春（2/3"4），山东蒙阴县人，福州大学侨兴轻工业学院讲师，华东理工大学在职博士研究生，主要从事生物化工及分子生物学方向的研究。收稿日期："$$20$302%，修回日期："$$202$02%?%’微生物学报*&卷杨胜利院士馈赠；!"#$%&、!"#’((：厦门大学生物技术学院苏文金教授馈赠。!"#工具酶及试剂实验所需限制性内切酶、)*+,-连接酶、抗生素及试验所需试剂分别购自华美、./012345公司和67425公司。!"$质粒构建及转化方法

6、大肠杆菌的质粒构建方法及转化方法参照文献［’］进行；链霉菌质粒提取及构建方法参照文献［’，$］；金色链霉菌原生质体制备、转化及再生见文献［$］。!"%培养基及培养方法［’］［$］［$］培养基：89培养基、:;<;培养基、金色链霉菌再生培养基。金色链霉菌发酵培养基组成（4=8）：可溶性淀粉*%，玉米浆>%，黄豆饼粉&%，蛋白胨’，酵母粉?，@5@A?’，B&C.A*%D>，<46A*%D>，!C调至’DE。摇瓶培养条件：?>F，摇床转速&G%/=27H，培养$&I。!"&测定方法［G］透明颤菌血红蛋白测定采用J3KL3/HMN0LL7H4及@A差光光谱法。

7、金霉素含量测定采用C.8@测定（9-@B<-,6:6);G反相柱；流动相为乙［(］腈及(220N=8磷酸盐，用>20N=8,5AC将!C调至’DE；流速为>28=27H）。#结果和讨论#"!含!"#基因的大肠杆菌’链霉菌穿梭质粒的构建（见图!）利用!Y@>(（!"#）和!"#’((构建穿梭质粒（图>）。利用!"#的天然启动子，研究!"#在金色链霉菌内进行表达。对转化后得到的克隆子在低溶解氧条件培养后，J3KL3/HMN0LL7H4及@A吸收检测表明，在*&%H2处有一明显的吸收峰，表明!"#在金色链霉菌内实现了

8、表达（图&）。在?%28和’%28装量的摇瓶培养条件下，对随机挑出的E%株克隆子