脱氧核糖核酸(DNA)制备

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1、脱氧核糖核酸（DNA.）的制备王尔中（中国科学院动物研究所）在实验生物学的研究中，DNA的制备已缓冲液中。成为一种常用的方法。根据实验材料和研究目（二）非离子性乳化荆溶胞法［[t]的不同，所用的制备方法也不同。本文主要介此方法是用轻度溶胞法，可以使细菌细胞绍质粒DNA和其它（动物组织、细菌）DNA的染色体DNA仍然与细胞膜结合在一起，这常用的制备方法。样就能在低速离心中将染色体DNA与质粒DNA分开。一、质粒DNA的制备非离子性乳化剂多氧乙烯十六烷醚（即Brij质拉(plasmid）是共价闭合环

2、状的超螺旋58)，可以用来分离质粒DNA。通常所使用的DNA。它的碱基比例与染色体DNA不同，质蔗糖缓冲液和溶菌酶制备的细菌球形体，在脱粒DNA分子量小，而染色体DNA分子量大。氧胆酸盐（DOC）和EDTA存在的情况下，加根据这些特点，研究人员采用一些实验技术进人Brij58溶胞，在低速离心中绝大部分（90外）行提取纯化。常用的方法有以下几种。的染色体DNA会沉降下来，而质粒DNA保（一）Hirt改良法持在上清液中。因为脱氧胆酸盐可以分解细胞此方法可以用来提取质粒DNA或分子量膜的脂蛋白或脂多糖

3、，因此质粒DNA可以与小的DNA（如噬菌体、病毒或线粒体DNA)o细胞膜分离。这一方法广泛应用于分离质粒将细菌培养到3X105细胞／毫升浓度（590DNA与染色体DNA.ml‘处0·D约为0.6-0.8)040C,600g离心10（三）质粒DNA的提纯方法分钟收集菌体。然后重新悬浮于5倍体积的10一般地说，上述两种方法分离的质粒DNAmMTris-HC1pH8.0,1mMLDTA缓冲液中。都比较粗放，需进一步纯化。常用的纯化方法轻轻摇动混合，加20毫克／毫升的链霉素蛋白酶有以下三种。K，使最终浓

4、度到50微克／毫升。然后再加10务1．两相法［[2l的SDS，使最终浓度达1多。在37℃下保温30分此方法是继冷酚法抽提之后，用酒精沉淀钟，然后慢慢加人4M氯化钠，使最终浓度为出DNA（还包括各种RNA)。它是一种专门1M（此步骤必须边加边摇），混合均匀，再于4cC,提取闭合环状双链DNA的快速方法之一。放置过夜。过夜后，在40C,10000g离心30分在供试DNA悬液中加人少量IOmMTris-钟，取上清液，加入等体积的三氯甲烷一异戊醇HCI,pH8.0,1mMEDTA缓冲液。在100℃加(2

5、4:1)混合液，再加入等体积90%的苯酚，00C热2分钟后，迅速放入干冰一酒精溶液中冷却。下搅拌30分钟，再置于40C,1500g离心10分然后加2-，倍体积的葡聚糖500(16.8多W/钟。吸出水相层，加二倍体积冷乙醇(-20cC),W),1.25倍体积的聚乙二醇6000(18.4多W/于一20℃放置过夜。过夜后，在一100c,1oooogW）和十分之一体积的0.5M磷酸钠缓冲液pH离心10分钟。将沉淀溶于少量pH8.1的106.8,温度保持在40C。然后再加水，使体积成.mMTris-HCI

6、,50mM氯化钠、0.1mMEDTA为原体积的，倍。充分混匀，在4℃下低速离32心，回收含有过量聚乙二醇的上清液。加入氯中）。40C、匀浆3分钟，1000g离心1，分钟，弃化钠，使最终浓度为0.2A1后，加二倍体积的酒去上清液（此步骤重复两次）。沉淀加9毫升缓精，使DNA沉淀。沉淀用75多的酒精洗后，冲液，用磁力搅拌器搅匀，再加九分之一体积的溶解于缓冲溶液中。十二烷基硫酸钠（简称SDS)，再将它溶解在2.硝酸纤维素滤膜吸附法W45%酒精里，室温下轻微搅动一小时。缓慢加此方法主要是通过硝酸纤维素滤

7、膜使单链人5％的固态氯化钠，并继续在室温下搅动，后染色体DNA与双链质粒DNA分开，以达到于4℃放置过夜。过夜后4℃下3900叱离心二除去染色体DNA，纯化质粒DNA的目的。小时。取上清液逐滴加入二倍体积的无水酒精经适当条件修剪后，可以使染色体DNA（同时轻微搅拌），用玻璃棒卷起DNA纤维，然和质粒DNA混合物中的染色体DNA成为碎后用75酒精洗数次。片，而质粒DNA仍保持完整（因为质粒分子（二）染色体DNA的分离〔31量小）。如果这种切断的染色体DNA和质粒收集细胞（2-3X10‘细胞／毫升）

8、，用冷的DNA受到高温或PH大于11.，的处理，破坏亨克民平衡盐溶液（BSS)清洗三次后，加人皂染色体片段双链DNA之间的氢键，使双链草贰(saponin)，使最终浓度为0.3多。静置5分DNA变成单链DNA（即变性），而质粒DNA钟后，再用BSS洗二次。悬浮于SSC（即0.5m因为呈闭合环状，不会发生单链变性现象。依氯化钠，0.015M柠檬酸钠中），再加SDS，使浓据单链DNA可以被吸附在硝酸纤维素上，而度达0.2沁。双链DNA不被吸附，这样就可以使单链染色在澄清粘液中，加人核糖核酸酶A（即R