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1、·870·生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2004;31(10)3在体膜片钳技术的新进展33杨胜周文霞张永祥(军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850)摘要在体膜片钳是指在整体动物上直接对其中枢神经元进行全细胞膜片钳记录的技术,在生理学和药理学研究中具有良好的应用前景.常规采用的是盲法记录,最近出现的可视法记录,采用双光子靶向膜片钳(two2photontargetedpatching,TPTP)技术,通过基因操作在动物脑内目标神经元中构建特异表达的荧光标志,可以做到对特定神经元亚群的靶向研究.对这两种方法的原理和操作进行了简单
2、的介绍.关键词膜片钳,在体,双光子显微镜学科分类号Q42420世纪70年代,德国Max2Planck(马普)生观察来自不同方向的光刺激所对应的突触后电流反[1]物物理化学研究所的Neher和Sakman发明了的应,以此探讨视觉信号传递和形成机理,以及视皮膜片钳技术(patchclamptechnique),从而使对细层神经元功能和结构的关系.随后日本和美国的两胞电活动的研究精度提高到1pA的电流分辨率,家实验室几乎同时把记录的部位从大脑神经元改到1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率水平.脊髓神经元(LaminaeⅠ2Ⅱ区),用以研究机体对[5,6]这一技术的出现
3、促进了以细胞和脑组织片为标本的各种伤害性或非伤害性刺激反应的神经通路.生命科学研究.从技术上讲,脊髓的全细胞记录比脑部神经元的难在过去的几十年间,生物物理学的研究主要以度更大,因为脊柱难以固定,而且受循环和呼吸运离体标本为主.但是,如想研究一些外界刺激对神动的影响更大,所以使高阻封接难以维持足够长时经系统的影响,在离体标本上是无法实现的,而且间.目前关于啮齿类动物整体全细胞记录的报道较离体的细胞和分子水平研究和整体的真实情况可能少,从事此类研究的实验室也只有少数几家,集中存在较大的差异.因此,在活体动物上对微小生命在德、美、日等国家,国内也开展了一些在体膜片[7～9
4、]活动进行直接观察一直是追求的目标.早期对神经钳的工作,进行神经生理和神经药理学研究,系统的整体电生理学研究以胞外记录为主,由于技说明这些技术的难度确实很高.术方法的局限性,忽略了大量有价值的生物信号.1盲法的在体全细胞记录最近出现的在体膜片钳技术可以较好地解决这一问题,可在动物整体无损的前提下,深入研究大脑和对猫或大鼠进行在体膜片钳记录时,前期准备脊髓神经元离子通道和突触活动的特点,以及病理主要有:动物麻醉后,继续静脉点滴麻醉剂以维持变化和药理作用.在体膜片钳是指在麻醉动物上直深度麻醉状态,同时适量补充葡萄糖;必要时需做胸廓切开术并使用人工呼吸机,同时检测CO2潮
5、接对其脊髓或大脑神经元进行膜片钳记录的技术,气量、血压、心跳等.以上准备完成后,动物固定与分散神经元或组织片膜片钳技术比,最突出的优于立体定位仪,进行解剖以暴露神经元.点是能够在施加外界刺激的同时,在整体条件下研暴露清洁的皮层有利于提高封接的成功率.尽究中枢神经元离子通道和突触活动的特点,为从宏量减小开颅的面积,以减小呼吸和心跳对皮层的影观角度研究和探讨中枢神经系统的生物物理现象提响.完全去除硬脑膜以避免电极污染.为减少局部供了更精确的手段.运动和分泌,可使用阿托品.当电极接近脑表面20世纪90年代一些实验室在借鉴脑片膜片钳技术的基础上,尝试在整体动物(一般是麻醉状
6、3国家自然科学基金资助项目(30171153).33态)上进行膜片钳记录.最早的报道是Pei和通讯联系人.[2～4]Tel:010266931625,Fax:010268211656Volgushev等在德国马普研究所的工作.他们E2mail:zhouwx@nic.bmi.ac.cn通过对成年猫视皮层神经元进行全细胞记录,然后收稿日期:2004204214,接受日期:20042052302004;31(10)生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.·871·时,在电极周围灌注温热的琼脂以覆盖暴露的脑表接.同时通过钳制电流水平,实时监测钳制状态
7、.面,保持脑表面的湿度.琼脂凝固后还起到缓解脑电流钳状态下,监测膜片电极与细胞膜的阻抗,数血管波动的作用.整个实验过程要使用加热装置,值变化幅度较大,利于确定封接状态.因此可根据保持动物体温恒定于37℃.记录脊髓神经元时还具体设备任意选用.需切除脊椎后弓,并去除位于软脑脊膜及硬膜之间2可视法的在体全细胞记录的精细膜,以暴露脊髓神经.这些繁琐的步骤必须完成,以最大限度地减少呼吸循环运动等造成的系211双光子激光扫描显微镜统不稳定性.有学者认为保留硬脑膜可减缓脑部的盲法的在体全细胞记录只能通过解剖定位来实波动,通过胶原酶消化,使硬脑膜变软以利于电极现对某一区域神经元
