糖尿病小鼠血清糖基化终产物水平增高

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1、糖尿病小鼠血清糖基化终产物水平增高中国糖尿病杂志2000年第5期第8卷短篇报告作者：孙子林　刘乃丰　孙桂菊　童嘉毅　王伯荣　刘必成单位：东南大学附属中大医院内分泌科邮政编码210009　　DCCT［1］和UKPDS［2］研究均证明长期持续高血糖与糖尿病慢性血管病变的发生密切相关。高血糖导致血管病变发生发展的机制尚不完全清楚，蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物(advancedglycationendproducts,AGEs)可能发挥重要作用［3］。为了从整体水平研究AGEs与糖尿病慢性并发症之间的关系，我们运用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定糖尿病小鼠血清AGEs水平，并分析其与肾

2、功能、尿蛋白及尿微量白蛋白排泄之间的关系，现报告如下。　　材料和方法　　一、材料　　1.试剂：牛血清白蛋白(BSA)为BM产品，人血清白蛋白(HSA)、明胶、四氧嘧啶、邻苯二胺(OPD)为Sigma产品，生物素化羊抗兔IgG、链霉亲和素-HRP系Vector产品，其它试剂均为国产分析纯。　　2.仪器及器材：Model550酶标仪为美国Bio-Rad公司产品，SN-682B型γ计数仪为上海核福光电仪器有限公司产品。　　3.动物：雌性新西兰白兔两只，兔龄4～5个月，体重2～2.5kg，购自江苏省农科院种殖场；雄性昆明种小鼠，18～22g，由东南大学医学院动物实验中心提供。　　二、方法　　1

3、.糖尿病动物模型的制备：小白鼠40只随机分为两组，实验组按400mg/kg腹腔一次性注入四氧嘧啶，分别于30天、60天各处死一半，处死前24小时收集尿液计算尿量并测定24小时尿蛋白定量(24hUPro,Bradford法)、尿白蛋白排泄量(UAE，放免法)，收集血清测血糖(葡萄糖氧化酶法)、尿素氮、肌酐(Cr)及AGEs。　　2.AGEs的制备：50g/LHSA、BSA分别与0.5mol/L葡萄糖共溶于pH7.4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，过滤灭菌后置37℃避光孵育90天，用PBS充分透析以去除未结合物。不加葡萄糖的HSA、BSA同上操作用做对照。样品调定至1mg/ml

4、，按常规方法测定AGE荧光值及荧光光谱扫描。Sephadex-G200纯化AGE-BSA。　　3.抗AGE抗体的制备：参照Hourichi方法［4］。用纯化的AGE-BSA与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化后，背部皮下多点注射免疫新西兰白兔(1.0mg/次)，此后1次/周，同样剂量加强5次，最后一次以AGE-BSA2.0mg与弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫，再隔10天后无菌条件下颈动脉放血收集血清，QAE-SephadexA-50纯化获取IgG。　　4.运用竞争性ELISA检测血清AGEs：100μl/孔AGE-HSA(5μg/ml)包板，室温孵育过夜。PBS-T液漂洗6次，0.5%明胶封闭1

5、小时。再次漂洗后，加入抗AGEIgG(1∶2000稀释)和血清(1∶4稀释，一式三份)或标准品(纯化AGE-BSA，浓度分别为0.625、2.5、10、50、100mg/L)各50μl/孔，置37℃孵育1小时。同上漂洗后，加入100μl/孔生物素化羊抗兔IgG(1∶4000稀释)，37℃孵育1小时。漂洗，加入100μl/孔链霉亲和素-HRP(1∶4000稀释)，37℃孵育半小时。漂洗，加入100μl/孔OPD液，37℃孵育20分钟，加入100μl/孔2mmol/LH2SO4终止反应。空白孔调零，酶标仪测490nm吸光度。根据事先输入的标准品浓度及其在微孔板上的位置，酶标仪自动求出样本的

6、AGEs浓度值。浓度以U/ml表示，1UAGEs相当于1μg/mlAGE-BSA。　　5.数据处理：所有数据均以±s表示，采用非配对资料两样本均数t检验进行差异显著性检验，相关采用直线相关分析。　　结　果　　1.一般资料［5］：实验组血糖为对照组3倍左右，体重下降(约为对照组的2/3)，早期尿量增多，3周后逐步减少，24hUPro升高达对照组6倍，尿素氮、肌酐为对照组2倍，UAE为对照组3～4倍。模型组60天时上述指标增高较30天时更为明显。　　2.AGE荧光检测：AGE-BSA和AGE-HSA荧光值分别为5.31±0.21和5.44±0.19；而BSA和HSA分别为0.174±0.0

7、11和0.202±0.015。荧光光谱扫描显示AGE-BSA和AGE-HSA激发高峰位于360nm，发射高峰位于446nm。　　3.ELISA测定AGEs：糖尿病小鼠血清AGEs明显高于对照组，约为对照组的6～8倍(30天组：4.28±1.32vs0.51±0.35U/ml;60天组：6.74±2.28vs1.16±0.60U/ml)。　　4.血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE相关分析：对血清AGEs与Cr、24hUPro、UAE进行相