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时间:2019-06-06
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1、8生物反应工程领域的拓展教学基本内容:介绍质粒复制与表达的动力学;超临界相态下的生物反应;菌体形态在发酵液中的变化;界面微生物生长模型。8.1质粒复制与表达的动力学8.2超临界相态下的生物反应8.3菌体形态在发酵液中的变化8.4界面微生物生长模型授课重点:1.质粒复制动力学以及基因表达动力学2.菌体形态对传质的影响3.界面微生物生长动力学模型难点:1.质粒复制动力学模型的建立2.界面微生物生长动力学模型的建立本章主要教学要求:1.理解质粒复制动力学以及基因表达动力学。2.了解超临界相态下的生物反应3.理解菌体形态对传质的影响4.了解界面的概念5.理解界面微生物
2、生长动力学8生物反应工程领域的拓展1980年前后,生物工业的核心是微生物发酵工业,此时的生物化学工程领域更多地开展微生物培养工学方面的研究。由于1972年重组DNA技术的出现,1985年PCR技术的开发成功,极大地拓宽了生物反应工程所涉及的的领域。与此同时。人们对极端条件下微生物活性的变化以及微生物形态变化等方面,给予了更多的关注。拓宽了生物反应工程领域。8.1质粒复制与表达的动力学利用DNA重组技术提高微生物生产有用物质能力已取得可喜的成果。为进行工程菌株发酵过程中的优化控制,有必要研究目的产物的产率与质粒的基因结构、基因数量,宿主的遗传特性及发酵过程中操作
3、条件等之间定性与定量的关系。当基因的表达仅取决于微生物细胞所含基因数量时,工程菌细胞中所含质粒的稳定性及其复制与表达能力成为至关重要的因素。由于质粒的复制数对于提高工程菌株的生产能力是重要的决定因素,因此,下面简要介绍质粒复制与表达的动力学模型。8.1.1λdv质粒的概述λdv质粒是从λ噬菌体中分离得到的小突变体,分子量为4.7×166,约为λ噬菌体的十分之一。λdv质粒的“核心区域”由自身控制区域和启始复制区域两部分构成。前者包括启动子基因、操作子基因、自身阻遇物基因和终止物基因;后者含有复制起源基因和初始物基因两部分。质粒复制子的基因结构(Matsebar
4、a,Mukai1975)λdv基因群是在PROR的支配下进行表达,I与Pr的复合体IPr和活性ori的相互结合控制着基因组的复制,而cro阻遏蛋白积聚起来会抑制自身操纵子的转录,最终是作为自身阻遏物而起作用。8.1.2动力学模型的几点假设1、λdv质粒是由PRORP基因构成的一单体形式;2、由于I蛋白质不稳定,其作为限制性初始物而起作用;3、λdv质粒是以随机模型的方式进行复制,这已由DNA密度沉降实验所证实;4、复制起源点由于转录作用而活化,初始蛋白与活性化ori相结合形成一复合体,为起始复制,复合体的活性要达到某一临界值;5、细胞分裂时,质粒以均等方式进行
5、分配;6、宿主细胞的体积以指数形式增长,质粒对宿主细胞的生长无影响。8.1.3质粒复制动力学λdv质粒复制动力学方程式见表8-1。动力学模型是以单细胞为基准,并假定mRNA与蛋白质的失活服从一级反应规律。1.R的合成(8-1)(8-2)2.I的合成(8-3)(8-4)3.ori的活性化(8-5)4.复制体的形成(8-6) 式中η称为转录效率。PROR处的转录效率是由RNA聚合酶与自身阻遏蛋白R相互作用竞争性与PROR结合所决定。由于启动子基因和操作子基因重合在一起,因此,R与OR1和0R2两者或之一相结合都会抑制启动基因。由统计热力学理论,可求得转录效率η为(
6、8-7)式中,;为R的总浓度;Kl、K2和K3分别为R与OR1、0R2和0R3的结合常数,表示R与OR1、0R2和0R3的亲和力。(8-1)和(8-2)式为R的合成动力学方程,两方程右边第一项分别为mRNA与R的生物合成量;第二项分别为mRNA与R的失活量,第三项为由于宿主的生长而导致mRNA与R的变化量。mRNA与蛋白质在细胞内的浓度以单位体积细胞的摩尔数来表达,并随细胞的增殖而下降,两者的活力随失活作用而下降。在某一时刻t,质粒DNA浓度[G]为(8-8)式中G为每一个细胞内的质粒分子数;V为时间t时的细胞体积;NA为阿伏伽德罗常数()。呈指数形式增殖的单
7、一细胞每一世代中的体积变化可由下式来表示。时,(8-9)式中V0为新生细胞的体积;τ为宿主的增倍时间。在tR1处的转录终止效率f取值范围为0至1。o基因的转录速率与η、(1-f)和呈比例关系,I蛋白的生物合成方程式如(8-3)和(8-4)式。根据上述,通过启始复制领域的转录,使ori部位活性化,即由于o基因的转录频率决定了复制起始领域的活性化,形成具有活性的。(8-10)具有活性的与非活性的关系为(8-11)式中为ori的总浓度。将(8-11)式代入(8-10)式,可得(8-5)式,在(8-5)式中(8-12)由于λdv质粒是以随机选择模型进行复制,一定时间间
8、隔内,仅有一个质粒进行复制。因此,由(
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