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《巯基修饰对中华仓鼠二氢叶酸还原酶的激活》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第15卷第1期中国生物化学与分子生物学报Vol.15,No.11999年2月ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiologyFeb.1999·研究简报·巯基修饰对中华仓鼠二氢叶酸还原酶的激活*范映辛李震宇周筠梅(中国科学院生物物理研究所,生物大分子国家重点实验室,北京100101)ActivationofDihydrofolateReductasefromChineseHamsterbySulfhydryl-modificationFANYingxin,LIZhenyu,ZH
2、OUJunmei(NationalLaboratoryofBiomacromolecules,InstituteofBiophysics,ChineseAcademyofScinence,Beijing100101)AbstractTheactivityofdihydrofolatereductasefromChinesehamstercanbeincreased2.4,1.8and1.4folduponthemodificationofitssulfhydrylgroupwithp-hydroxylmercuriben
3、zoate(p-HMB),p-hydroxylmercuriphenylsulfonate(p-HMPS)and5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoateacid)(DTNB)respectively.Theactivationoftheenzymeby400-foldmolarexcessofp-HMBwasa-1monophasicprocesswitharateconstantof0.015s.Theextentsofactivationaswellastherateofactivationwas
4、loweredinthepresenceofthesubstratedihydrofolate,butwasunaffectedbytheothersubstrateofNADPH.Themodifiedenzymecouldbefurtheractivatedbyguanidinehy-drochlorideandpotassiumchloride,butnotbyurea,whichsuggestingthatthemechanismoftheactivationofdihydrofolatereductasebyi
5、onswasdifferentfromthatbyproteindenaturantsandsulfhydryl-modifying.Itseemsthattheactivationoftheenzymemaybeduetotheincreaseintheflexibilityoftheenzymeattheactivesitebythemodificationofthesulfhydrylgroup.KeywordsDihydrofolatereductase,Sulfhydryl-modification,Activ
6、ation[8]脊椎动物二氢叶酸还原酶(DHFR,E.C.1.5.1.2.1ch-DHFR活力测定:酶活力按Mathews[1]1.3)可被多种因素激活,如中性无机盐、蛋白质变的方法在20℃下用岛津UV-250分光光度计测定.[1～4][1,4～7][5]性剂、巯基修饰剂等.来源于鸡肝、猪1.2.2ch-DHFR的巯基修饰:在50mmol/L[6][7][4]肝、鼠肝及鼠L1210细胞二氢叶酸还原酶的pH7.5的磷酸钾缓冲溶液中,酶浓度为12mol/L,巯基修饰激活已有报道.我们建立了ch-DHFR的加入指定浓度的修饰
7、试剂,20℃保温10min后测高效表达及纯化方法并研究了其在脲和盐酸胍中的活.DTNB与酶的修饰反应可通过412nm处吸光[8]激活现象,本文报道三种巯基修饰剂对ch-DHFR度的变化监测,与酶反应的修饰剂的量用摩尔消光-1-1的激活作用和激活酶的性质.系数差13400mol·L·cm计算;p-HMB与酶的修饰反应通过250nm处吸光度的变化监测,与1材料与方法酶反应的修饰剂的量用摩尔消光系数差7600-1-11.1材料mol·L·cm计算.ch-DHFR按文献[7]的方法表达纯化.酶浓度2结果与讨论通过光吸收法测定,摩
8、尔消光系数为280=28600-1-1mol·L·cm.DHF,NADPH,p-HMPS,p-2.1ch-DHFR的修饰与激活HMB购自Sigma,DTNB购自Fluka;盐酸胍为Fig.1是3种修饰剂浓度与ch-DHFR活力的关ICN酶级超纯试剂;脲为BoehringerMannheim超纯重结晶试剂,所用溶液均
