一图多用的变式解析

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1、阿哈湖深层水中微生物和硫酸还原菌数量及群落结构空间变化本文章中细菌FISH操作流程：材料方法：1.样品采集于2006年6月使用Niskin采样器，从18m深度开始按1m间距采集贵州阿哈湖水深22m处的深层湖水，共采集5个样品（编号为Aha06101-Aha06105），样品立即用45多聚甲醛进行固定。2.主要试剂和仪器：多聚甲醛（Sigma，美国）；明胶（Oxiod，美国）；丫啶橙（Sigma，美国）；DAPI（Sigma，美国）；荧光显微镜（Olympus，日本）。3.荧光探针采用EUB338和SRB38

2、5寡核苷酸探针，5’端Cy3标记（表1），由上海生物工程技术服务有限公司合成。表116SrRNA探针的靶细菌种属和探针序列探针名称序列（5’-3’）检测的微生物EUB338GCTGCCTCCCGTAGGAGT真细菌SRB385CGGCGTCGCTGCGTCAGG硫酸盐还原菌4.荧光原位杂交法对阿哈湖深层水环境总微生物、真细菌和硫酸盐还原菌数量的分析4.1样品预处理取1ml样品用直径25mmGTTP滤膜过滤后，1mlPBS洗涤3次后，0.5ml50%、80%和99.5%乙醇分别洗涤，每次3min，风干。4.2

3、原位杂交湿盒中适量加入杂交缓冲液（EUB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1Tris-Hcl，0.01%SDS，20%formamide；SRB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1NaCl，20mmol·L-1Tris-Hcl，0.01%SDS，35%甲酰胺），将包被有明胶的玻片放于湿盒中，膜放于玻片上。25ng·μl-1探针4μl和杂交缓冲液20μl混匀后，滴加于膜上，38℃90min；取出膜放入洗涤液中50℃20min（EUB探针洗涤液0.18mol·L-1NaCl，20mmol·L-1Tris-Hcl，0

4、.01%SDS，5mmol·L-1EDTA；SRB探针洗涤液0.40mol·L-1NaCl，20mmol·L-1Tris-Hcl，0.01%SDS，5mmol·L-1EDTA）水洗膜，风干；&O&-/7·/?K-的<1=>4&"?复染，避光-0/*$，水洗，风干。4.3镜检将膜放于油镜下观察。在EUB探针和SRB探针杂交的实验中，采用WG滤光片，计数发红色荧光的菌体分别为真细菌和硫酸盐还原菌数目；采用WU滤光片，计数发蓝色荧光的菌体即为总微生物数。每个样品均平行分析3次，取均值。5.丫啶橙染色对湖水微生物活

5、性的测定取1ml样品加入3滴0.1%丫啶橙溶液，染色3min，苏丹黑B染色的直径0.2μm滤膜过滤，水洗1次，风干。Olympus油镜下计数，滤光片为WB。丫啶橙与DNA结合后菌体发绿色荧光，和RNA结合后菌体发红色荧光。观察菌体为黄色或红色示该细菌为活性状态，而绿色为非活性状态，分析样品中活性微生物所占数量。每个样品均平行分析3次，取均值。产氢反应器内两种发酵类型细菌的种群结构与发酵特征本文中FISH的操作FISH监测：研究结果表明，大多数产氢发酵细菌属于梭菌属(Clostridium)和肠杆菌科(Erz

6、terobacteriaceae).通过查询probeBase寡核昔酸数据库，获得了它们的专一性探针以及与其他发酵菌专一性杂交的探针的寡核昔酸序列，分别为:Chis150，专一杂交ClostridiumclusterI和II(序列为5’-TET-TTATGCGGTATTAATCTYCCTT-3’);C1it135，专一杂交ClostridiumclusterXI(序列为5'-FITC-GTTATCCGTGTGTACAGGG-3').另选择探针ENT183(序列为5'-ROX-CTCTTTGGTCTTGCGA

7、CG-3')，专一杂交Euterobacteriaceae.探针的合成与荧光素标记均由Invitrogen公司完成，置于-20℃下避光保存.使用前用超纯水将探针稀释到5ng·mL-1分装备用。实验操作如下:①取样:取反应器中的活性污泥，用灭菌玻璃珠振荡打碎，1000r·min-1离心2min,将上清液5000一8000r·min-1离心2min，弃上清液，再用PBS将收集到的细菌冲洗1次。②固定:用4%多聚甲醛溶液固定，4℃过夜.杂交实验前，用PBS液清洗，离心收集.③预处理:用蛋白酶K,37℃消化30mi

8、n,减少蛋白质对杂交的影响.再用溶菌酶处理lOmin，以增加细胞的通透性.最后用梯度酒精(50%,80%,95%,100%)依次脱水.④杂交:探针在杂交前加人杂交液中(0.9mol·L-1NaCI,20mmo1·L-1Tris一Cl，0.1%-1%SDS，5%一55%甲酞胺)，使其终浓度为5ng·mL-1.杂交在载玻片上进行，取经过预处理的样品10μL涂于载片，充分干燥后，加20μL杂交液，置于密闭湿盒，46℃杂