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《膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第27卷第4期动物分类学报Vol.27,No.42002年10月ACTAZOOTAXONOMICASINICAOct.,20023膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取朴美花陈学新何俊华(浙江大学应用昆虫学研究所杭州310029)摘要提出了膜翅目昆虫干标本基因组DNA的提取方法,通过对实验结果和所测得的基因片段(28SD2rDNA)的分析,表明该方法可行。关键词基因组DNA,膜翅目,干标本,提取.中图分类号Q966近年来,昆虫分子系统学和进化研究迅猛发展,对昆虫分子系统发育中常利用的分子标记如mtDNA和rDNA的测序要求快速有效,因此昆虫中有效基因组DNA的提取是重要
2、的前提。许多研究者介绍的基因组DNA的提取方法中所采用的材料基本上是新鲜样品或超低温冷冻标本(Blin&Stafford,1976;Bowtell,1987;Gross2Bellarddetal.,1972;Kupiecetal.,1987;王文和施立明,1993),但是分子系统发育和进化研究中经常出现所研究的类群,特别是稀有类群难以得到新鲜材料的问题,因此往往需要利用自然博物馆或标本馆的干标本提取基因组DNA,但干标本保存时间越长基因组DNA的降解也越严重。因此,如何从干标本中提取基因组DNA的方法对系统发育和进化研究至关重要。本文结合膜翅目寄生性种类分子系统发育
3、研究,对干标本中的基因组DNA的提取方法进行了探索。1材料和方法1.1材料浙江大学应用昆虫学研究所标本馆里保存的分别采于1987年(山东济南,2头)、1980年(浙江奉化,2头)、1954年(湖南东安,2头)及1935年(江苏宜兴,2头)的松毛虫脊茧蜂AleiodesesenbeckiHartig(膜翅目:茧蜂科:内茧蜂亚科)干标本。每次DNA提取使用较完整的1头松毛虫内茧蜂胸腹部及足,重复进行2次。本实验所采用的松毛虫脊茧蜂标本,采集时用KCN毒死,阴干后制标本,一直保存在密封、控制湿度的标本馆里,因此采集及保存条件几乎完全一致。112设备PCR仪(TECHNEF
4、PROG05D),电泳仪(大连JM2250),台式高速冷冻离心机(SIGMAD237520),恒温金属浴(大和CHB2100),微波炉(GALANZ),匀浆器,紫外透射仪(TANONUV2000),数码相机及其附件(KODAKDC120),紫外分光光度仪(PERKINELMERMBA2000)。113基因组DNA提取3国家自然科学基金资助项目(编号39970099).收稿日期:2002O04O02,修订日期:2002O04O20.6724期朴美花等:膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取673常规DNA提取方法(Gross2Bellard等,1972)通常是:取虫体→碾
5、碎→在37℃下用ProK培育1h→乙酸钠/ETOH沉淀→溶于50mlMilliQ·H2O→-20℃保存。实践表明:常规方法只适用于从新鲜标本中提取基因组DNA,而对干标本却不能获得成功。为了从干标本中提取基因组DNA,笔者摸索了一套新方法,即在利用常规方法之前,进行比较关键性的处理。具体步骤如下:(1)在STE缓冲液(011mol/LNaCl,10mmol/LTris·ClpH810,1mmol/LEDTApH810)中浸渍5h[参考了Lambkin方法,在STE缓冲液中浸渍5h,碾碎组织,加入500μlTEbuffer(含有10%Chelexresin)和10μl
6、ProK(10mg/L),再次碾碎,53℃加热5h,93℃再次加热30min,冷藏备用。Dr.C.Lambkin,澳大利亚昆士兰大学动物与昆虫学系,通讯联系];(2)用冲洗缓冲液(10mmol/LTris·ClpH810,100mmol/LNaCl,1mmol/LMgCl2)冲洗2～3次;(3)将虫体(1头昆虫的胸腹部及足)磨成粉末;(4)加入分离缓冲液(10mmol/LTris·ClpH8.0,10mmol/LEDTA,1%SDS);(5)再加入蛋白酶K,37℃水中1h;(6)加入5mol/LNaCl混匀,5000g离心数秒;(7)等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶2
7、4∶1)反复抽提直到在界面上看不到蛋白质;(8)加入1/10体积3mol/LNaAc(pH512),再加入2倍体积的冰冷的100%乙醇,-20℃冰箱中放置015～110h;(9)50μlMilliQ·H2O溶解DNA。114PCR反应反应体系为:50μl体积,包括500ng以上的模板DNA,015μl215UTaq酶(Promega),5μl10×buffer,4μl25mmol/LMgCl2,1μl20μmol/LPrimers,5μl2mmol/LdNTPs(Promega)。引物:引用Dowton&Austin(1998)所采用的引物:扩增28SD2rDN
