病原生物学实验

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1、Pleaseattention!1.您进入实验室时，请穿着白大衣以保护自身安全！2.本实验课需要显微镜，请您携带学生证去四楼显微镜室领取！3.请您不要随意触碰实验用品，以免发生意外！张文钰病原生物学与免疫学教研室sqjcbwm@126.com实验一（5学时）一、实验室生物安全熟悉（1）微生物学实验室生物安全意义（2）实验室规则2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。2010年12月，东北农业大学28名师生在“羊活体解剖学实验课”中感染

2、布鲁氏菌病。2011年6月，东北农业大学免去该校动物医学院院长和党支书职务。感染病菌的学生称，羊没有被检疫，被染病的羊那天被几个班级的学生重复使用。感染的主要原因是：防护意识不强；操作失误，防护条件不足。P4实验室P2实验室P1实验室操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害操作能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物操作能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，尚无有效预防或治疗方法P3实验室病原生物学实验室规则

3、学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒。进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。实验室意外紧急处理办法1皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%碘酊或2%红汞涂抹。2烧伤：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。3化学药品腐

4、蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%硼酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1~2滴滴眼）。4菌液入口：立即吐入消毒容器内，1：1000高锰酸钾或3%双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。5菌液污染台面：2%~3%来苏尔或0.1%新洁尔灭覆盖30分钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3分后肥皂和清水洗净。6火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。二、无菌操作技术实验目的1掌握常用的细菌接种方法2熟悉细菌生长现象的观察方法（一）

5、细菌的分离培养和接种技术接种工具接种针和接种环L型玻璃棒接种环境接种罩、超净工作台或无菌室内进行。接种方法1.平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本。连续划线法：适用于含菌量较少的标本。分区划线划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/4—1/5.划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划线不能交叉重复.每次划完后应灭菌.连续划线法2.斜面接种法：用于菌种移种，以进

6、一步鉴定和保存菌种。3.半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。将上述已接种细菌的培养基置37℃恒温培养箱中孵育18～24h，观察细菌的生长现象。（二）细菌在培养基上的生长现象1.细菌在固体培养基中的生长现象菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落与菌苔菌落菌苔2.细菌在液体培养基中的生长现象混浊：大多数细菌沉淀：多见于链

7、状排列的细菌。菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆菌）。细菌在液体培养基中的生长现象菌膜菌沉淀均匀浑浊对照3.细菌在半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力现象三、细菌的形态学检查形态学检查分类一、不染色标本检查(活体）悬滴法压滴法二、染色标本检查单染法：简单染色，一种染料（美兰染色）复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、抗酸染色）革兰染色(Gramstain)1884年由丹麦医师Gram创立革兰染色是最

8、常用的一种染色方法，可以将细菌初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具有非常重要的意义.目的：1、掌握细菌涂片的制备及革兰染色