Northern 杂交试验计划报告

《Northern 杂交试验计划报告》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、Northern杂交试验一植物总RNA的提取1）．准备工作（1）RNase-free水的制备：用去离子水加DEPC（焦碳酸二乙酯），使其终浓度为0.01%，过夜搅拌，121℃高温灭菌30min，烘干备用。（2）枪头及离心管：用含0.1%的DEPC的去离子水浸泡过夜，枪头盒及装离心管的容器用三氯甲烷擦拭2贬，121℃高温灭菌30min，烘干备用。（3）研钵及其他所需玻璃器皿：在180℃烘箱中烘烤4h.（4）80%的乙醇：用RNase-free配置即可。（5）所使用的移液枪及其他无法灭菌的仪器均使用三氯甲烷擦拭几遍。（6）所用到的其他试

2、剂：异丙醇和无水乙醇都应该是未开封的。（7）其他所用到的溶液均用DEPC水配制。主意：试验操作整个过程中都要带上口罩和手套，接触到有可能造成RNase污染的物品时要黄手套，操作尽量迅速。2）．实验步骤（1）将-80℃保存的拟南芥植株称量后（约200mg）迅速转移至用液氮与人的研钵中，加入液氮，不间断的研磨植物组织直至成细粉末即可。（2）加入400微升BufferR-I,继续研磨直至样品完全融化，并且裂解液呈透明状。（3）见匀浆液转移至离心管中，加入150微升的BufferR-II，漩涡振荡15s/次，2次。（4）12000rpm4℃

3、离心5min。（5）小心吸取上清液，转移新的离心管中（切勿吸取沉淀）。（6）12000rpm4℃离心5min。（7）加入250微升异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，放置5min。（8）转移溶液于复合离心管的内管中，6000rpm4℃离心1min。（9）弃滤液，加入500微升BufferW1A于复合离心管的内管中，12000rpm,4℃离心1min。（10）弃滤液，加入700微升BufferW2于复合离心管的内管中，12000rpm,4℃离心1min。重复一次相同的操作。（11）弃滤液，12000rpm,4℃离心1min。（12）将

4、内管转移到一新的离心管中，往内膜中央加100微升BufferTE。室温放置1min后，12000rpm,4℃离心1min，洗脱液即为所提取的植物总RNA。注：脱盐液以上用到的溶液（试剂盒提供）BufferR-I：细胞裂解液BufferR-II：平衡液BufferW1A：清洗液，须实验前加相应量无水乙醇后使用BufferW2：，须实验前加相应量无水乙醇后使用BufferTE：10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,PH7.5RNA样品质量分析：完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA

5、。其中28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。植物总RNA中28SrRNA及来18SrRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kbRNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。3）mRNA的纯化及cDNA的合成（1）纯化①DNaseI处理(DNaseI,RNaseFree)在微量离心管中配制下列反应也，全量200微升。总RNA50ug10×DNaseIB

6、uffer20ulDNaseI（RNase-Free，5U/ul）8ulRNaseInhibitor(40U/ul)2ulDEPCH2Oupto200ul37℃恒温，650rpm震荡反应30min（eppendorf,Thermomixercompact）(以下用E.Z.N.A.TMmRNAEnrichmentkit,R6511-01进行纯化)②加200ulmRNABindingbuffer,混匀。③转移混合液于含50mgoligo(dT)纤维素的离心管中，充分混匀。④70℃水浴孵育3min。⑤室温26℃，1200rpm振荡孵育30

7、min。⑥将泥装混合物转入复合离心管的内管中，26℃，12000rpm离心1min。⑦弃去外管中的滤液，加500ulMrnaWashingBuffer于内管中，用力上下颠倒混匀，26℃，1200rpm振荡孵育30min。⑧弃去外管中的滤液。转移内管于新的外管中，加400ulmRNAElutionBuffer（70℃预热）与内管中，用力上下颠倒混匀，26℃，12000rpm离心1min。，收集滤除液于新的2ml离心管重中，重复相同一次操作。⑨加1/10体积的3MNaAc(PH5.2)于洗脱液中，混匀。再加入等体积异丙醇，混匀，-20℃

8、放置30min.12000rpm，4℃离心30min。⑩弃去上清液，12000rpm，4℃离心1min，用微量枪头吸去残留乙醇，通风橱，室温放置2到5min。用20ulRNase-Free溶解。（2）cDNA合成（用PrimeScri