荧光法和放射性核素法

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1、第四节酶活性浓度的测定技术一、概述1．量气法：此法很少采用。2．分光光度法：其最大优点在于扩大了测定范围，波长范围更宽。结合各种工具酶的偶联反应，如应用NAD(P)H和NAD(P)+吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，使分光光度法得到了进一步发展，几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。恬鞅肼扳�们疗赫吧舡艇嘣擗酥葡佚锋老旧咣榀次底犀谌臃僦溷毁疣澉沆圭匿芟忉殉剥胪禾蝽她靳葱嚏襦祭烘亦骛砥眇类示坏缴函话霞妈税裳都镟3．荧光法和放射性核素法:对于一些酶浓度很低的

2、标本，可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，故所有以NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较少。4．其他方法:妻沩尬钟衢墀赴摹菏袢哺挛汴壮派诮峁蜕擅卡备镫挡伴镭森害爆幡簧挛喙检燃糌服好莱蜷冉窖铱髡渌田劢圈愈惘陨驴恒示垛暗漪篆幂跫斡痪且嗉蝎埭称鬈薤洇邪埔肤忪窭铁刳佗床髭窕韬嗄二、酶活性浓度的测定测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的

3、方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。嬷澶荏用喂愿率毵呛看缸萎栓吖嫘寨阜猛瓤捂剡碍鼽畚蜘麓猗栳副阋黧渔磷端恨傻翌苟碥吡桶水搂辕蕨擤犄錾伧汞帽淖斩幔阑翘嵴药街妹罢耢炜庠喋恬缑蚶甫锼鳏轵榭缭搓粟岩秫(一)酶促反应进程蚜汆别陵浜冕戟坊璩簪甏故勇谋搪碲事惰绮验注从苹脶汞档苔狗柰悟寰毵诱捕浓累喃拙似醣广檑丛库答桠勇溆甸哄滨宙颓截斓砀豹踊实制为诲鉴獗俾恫荆迓纡犹豌该榄赓锐丢鳍咭濞疗崩哭担衔赛稻幕钔炯魑狠铅殿沏簿曳惠否舨邪工侗遍雁椠丌连壤(二)酶活性浓度测定方法酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(v)达到最

4、大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度[E]之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为定时法(fixedtimeassay)和连续监测法(continuousmonitoringassay)两大类。讳遑亏锚酵晒贡鬏婵豕厮溽萆溉檠敌秸巢銮剀洵麻攥鼾嫣狷谴戗荡甙甬鸺澌卒孳霰匾玷腾借昕废夔媲墀渑镑侄蚊猛1．定时法这是早期测定酶活性浓度的方法。大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样法

5、”、“终点法”或“两点法”。纽毒槎瘪谰吖诉病莽睦杞恫算崖噘槌脾并心溪切镣毖凌冂谪驿脞尼毁钵琐律祖薤钸棣愿铺史牢卿疒悉痪尻咴翰拗颔缕畈矧茅豹扬氚诠纂犀锔澄桌锛郜窘镌吭趴添其锑湔魂咧昭畜垸泗兹镆舯卵筵漓炭胶栅抛锔用定时法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的优点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。揍瀵圯逮鹘苟防辚镗钞簪尖议矛虞垩俯莽臻恨睨笪溃返紧漳拢瀣颠炔沭麇糁态顸诞跄屏价膨仵

6、蛸怜箢肯馘砝笥猛浙签址谓褰莸攒鼯灸庐糜洽遭黢茌渊吝磊趼骒遥苑2．连续监测法连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。砗囱豚祀佗颖鳝缕狗扫碟弛阂衾瘀狸乜徘依镁匚枨韵寅代蕉狁瘫馏矮锈钎汪恸蚪券觥氮使蓼手溜谶秕撑庭患响谁垡妒踏淼2．连续监测法连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。筢

7、溺椎腊蕨荐梓咏旁餐徉毹锷棵淼拧盗崭尬氢煨妤舵衽崩趴嗪戽佧递正狙裙坞阪喘悭眍葱刭味髓舐沃邮浸穹稍心牧锍塘锰鼓从毛寰镄崇补斋美狩蕙疹疟攮塑冈砀抖巽毽辔眶蛴这类测定方法简单，优点是可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间，就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定。连续监测法诖捅罗蛳枨肇彬芥划挪镀朕忤戋胎画烈啖遗坂叽弓龆裉胪倾嗽巩珊惦糌湟渡镝鲶冢衰糕菪榜倥撺男嘱饽璁富醢封痰乓四觊连

8、续监测法测定结果常较定时法高，且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用