PCR步骤-打印版

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1、才干+实干=成功RNA提取1）将组织从液氮取出，加入2ml离心管中，尾组织加入一颗氧化锆的小珠。脑、肝不用。2）加1mLtrizol，使用组织破碎机进行匀浆，30Hz，2min。视匀浆效果而定！3）匀浆后的组织液在冰上孵育5min。4）组织液加入200μL三氯甲烷，颠倒混匀后冰浴3min。5）以12000rpm的速度离心15min（4℃），可见蛋白沉淀。6）取300μL上清液移入装有700μL的100%异丙醇的1.5ml离心管。7）颠倒混匀，冰浴10min8）12000rpm离心10分钟（4℃），离心管底部可见白色RNA沉淀。8）弃上清，加1mL75%的乙醇，涡旋片刻。9）7400

2、rpm离心5min（4℃），弃上清。10）简短离心，用移液枪吸出残余乙醇，室温晾干3-5min。11）待RNA晾至半透明，视沉淀大小加入适量无RNA酶的水。可以少加，不要过量！11）55℃水浴10min并涡旋，使RNA完全溶解。反转录1）取1uLRNA，用紫外分光光度法测其浓度。一楼105公共实验室2）在1.5mL离心管中涡旋混匀如下试剂，简短离心后分装至PCR管中（20μL反应体系，可相应按照比例调整）：10×RTBuffer2μLOligodT2μLdNTP2μLQuantReverseTranscriptase1μLRNA=1000/RNA浓度RNase-freeH2O=13

3、-RNA体积涡旋混匀，简短离心后进行反转录：37℃1h94℃3min4℃保存备注：测RNA浓度需要携带：RNA移液枪（0.1-2.5，5-50μL）擦镜纸枪头RNase-freeH2OU盘才干+实干=成功才干+实干=成功PCR操作步骤25/20μL反应体系，可相应按照比例调整：体系明细25μL反应体系20μL反应体系2*TaqPCRMasterMix12.5μL10cDNA2μL1.6RNase-freeH2O8.5μL6.8Primer-Forward1μL0.8Primer-Reverse1μL0.8备注：RNase-freeH2O和cDNA体积可以根据扩增结果调整！PCR扩增

4、条件EF94°C预变性2min，94°C45s，60°C45s，72°C45s，共25个循环，然后72°C延伸10min。DI2&DI394°C预变性2min，94°C40s，61°C40s，72°C40s，共30个循环，然后72°C延伸10min。TRβA94°C预变性2min，94°C45s，67°C45s，72°C45s，共30个循环，然后72°C延伸10min；BTEB94°C预变性2min，94°C40s，66°C40s，72°C40s，共30个循环，然后72°C延伸10min。琼脂糖凝胶电泳将扩增PCR产物跑电泳-----1.2%琼脂糖凝胶电泳：以下是25ml的配法，具

5、体按照比例调整！25ml电泳液0.3g琼脂糖1μLEB备注：点样量一般为5μL，具体应根据扩增实际效果调整！