现代分生技术-郑丽舒

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1、大肠杆菌、质粒和噬菌体郑丽舒中国疾控中心病毒病预防控制所2013.04.15一、大肠杆菌二、质粒：常见质粒质粒的分离纯化感受态细胞质粒转化三、噬菌体：λ噬菌体及其载体M13噬菌体及其载体四、分子克隆主要内容大肠杆菌大肠杆菌中文名称：大肠杆菌外文名称：Escherichiacoli(T.Escherich1885)界：原核生物界门：变形菌门(Bacteria)纲：γ-变形菌纲(Proteobacteria)目：肠杆菌目(Enterobacteriales)科：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)属：

2、埃希氏菌属(Escherichia)种：大肠杆菌种(E.coli)大肠杆菌一般特征◆属于原核生物，是革兰氏阴性棒状杆菌(红色)◆有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜◆其染色体是长约30kb的双链环状DNA分子◆生长需求非常简单，在仅含碳水化合物和少量氮源及无机盐的培养基上即可生长◆兼性厌氧◆长度大约2um，宽0.8umDNA长度约为体长的1000倍Escherich在1885年发现大肠杆菌，广泛存在于人和温血动物肠道中，44.5℃发酵乳糖产酸产气。在相当长时间内认为是非致病菌。20世纪中叶，认识到一些特殊血清型

3、的大肠杆菌对人和动物有病原性，常引起严重腹泻和败血症。根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌（EPEC）分为4类：肠产毒性大肠杆菌（ETEC）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）肠出血性大肠杆菌（EHEC）肠黏附性大肠杆菌（EAEC）大肠杆菌大肠杆菌在分子生物学实验中的应用生物工程用菌株优点：★背景清楚：全基因组测序，共有4405个开放阅读框架。由于该菌株遗传背景清楚，并经过一系列突变筛选，使外源DNA在胞内不易发生重组或修饰，更适于作为基因操作的宿主菌。★生物安全：生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，这些菌株由于失

4、去细胞壁的重要组分，在自然条件下无法生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也可避免对自然界造成危害。★菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。★操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌在分子生物学实验中的应用缺

5、点：★基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区。原核：CDNA；真核：DNA★转录信号不同：真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开

6、始翻译。大肠杆菌在分子生物学实验中的应用缺点：★mRNA的分子结构差异：绝大多数真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译★缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统：表达产生的蛋白质不能进行糖基化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而产生的蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能）。★表达的蛋白质经常是不溶的，在细菌内形成包涵体，当表达的蛋白量超过菌体总蛋白10%时，容易形

7、成包涵体。★细菌的蛋白酶：可以识别降解真核生物的蛋白质产物。加拿大人FrederickBanting和CharlesBest于1921年首先发现胰岛素，1922年开始用于临床，1923年或诺贝尔奖。1965年9月17日，中国科学家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随着细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌。应用实例胰岛素由A、B两个肽链组成

8、。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共51个氨基酸组成。其中A7-B7、A20-B19四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B链连接起来。A链中A6与A11之间也存在二硫键。大肠杆菌的培养与保存LB培养基是培养大肠杆菌最常用的培养基。其它培养基都是在此基础上有所加减，可参阅有关手册。LB一般被解释为Luria-Bertani培养基，其发明人贝尔塔尼(GiuseppeBertan