柠檬酸、谷氨酸发酵机制

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1、一、柠檬酸简介柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citricacid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。第一节概述第四章柠檬酸发酵机制食品工业：主要作为饮品的酸味剂，用于各种清凉饮料，还有汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。也可用作油脂的抗氧剂；医药工业：是许多医药品的原材料，如柠檬酸哌吡嗪（驱蛔虫药）、柠檬酸铁铵（补血剂）、柠檬酸钠（输血剂）等。此外，柠檬酸还用在许多医药中做酸化剂；化学工业：柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂，来制造食品包装的塑

2、料薄膜；其它方面，如用于工业、民用的洗涤剂中作为助剂，制造无公害洗涤剂；用在混凝土中作缓凝剂；在电镀中、皮革业、油墨、晒图等工业中也被得到广泛应用。二、柠檬酸的应用概况三、我国柠檬酸生产现状生产状况：60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，

3、设备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。第二节柠檬酸合成途径与代谢调控1940年，Krebs:TCA；1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶；1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢；1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。一、柠檬酸合成途径的发现二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP

4、途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制1、磷酸果糖激酶（PFK）：（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响Mn2+缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？当培养基中Mn2+缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、

5、GLu、Arg、Gln等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。磷酸果糖激酶（PFK）的调节Δ柠檬酸和ATP对该酶有抑制生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量ΔMn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制2、CO2固定反应通过CO2固定反应提供C4二羧酸（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸（C4二羧

6、酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸+CO2===草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。草酰乙酸的积累利于加速柠檬酸合成（二）三羧酸循环的调节1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在（组成酶）；而控制铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力。顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸——顺乌头酸——异柠檬酸可逆反应。研究表明，黑曲霉中有

7、一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。铁为顺乌头酸酶的激活剂，3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引