病理学常用研究方法(研究生课程)

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1、病理学常用研究方法主讲人：王恩华整体水平：尸体解剖autopsy动物实验animalexperiment细胞水平：光镜组织切片light-microscope细胞培养cellculture流式细胞技术flowcytometry组织芯片tissuemicro-array组织微切割技术micro-dissection电镜透射、扫描、免疫电镜蛋白水平：1.免疫组化immunohistochemstry2.WesternBlotting3.组织芯片tissuemicro-array基因水平：1.原位分子杂交(组织、染色体Fish)insituhybridization2.基因芯片ge

2、nechip3.组织芯片tissuemicro-array4.PCR及测序等PCRandsequence一、免疫组化标准化问题探讨本世纪70年代问世抗体种类急速增加，交叉反应存在免疫组化技术方法不断问世使用的试剂或实验室条件不同操作人员的熟练程度病理医生的结果判定水平及关联知识解决标准化的问题势在必行(一)方法的选择目前常用的免疫组化方法有：PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等各种方法只要运用得好，都会得到满意的结果建议：在我们省内都采用S-P法S-P法的优点①方法统一②有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒③一般2-3小时(30’-60’)，而ABC法需1天，分子量小

3、(60KD)，穿透力强④灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生物素结合，而且结合键强⑤背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10S-P法与ABC法的区别S-P法：Streptaridinperoxidaseconjugataedmethod链霉菌素抗生物素蛋白——过氧化物酶连接法ABC法：Avidin-Biotinperoxidasecomplexmethod卵白素亲生物素——过氧化酶复合物法S-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白素和生物素即：卵白素中的4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结合，另一方

4、面还与复合物中的生物素结合一抗二抗卵白素生物素过氧化物酶A------B-------C一抗二抗链菌素抗生物素蛋白过氧化物酶ABC法：S-P法：(二)固定、包埋固定液：一般10%中性缓冲福尔马林，PH7.3-7.4(PBS配制)固定时间：应少于24小时，固定时间越长，抗原丢失越多固定液量或组织块大小：组织为1/3，固定液2/3大体标本：切下一块固定包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容

5、易脱片。因此，要控制蜡温在65℃以下(三)抗原修复(抗原暴露、抗原复原)组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性其原因是：①固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋白抗原发生了交联，形成网络②固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原抗原修复的目的：就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：只限于需要抗原修复的抗体①热微波高压锅水浴锅②酶消化胰蛋白酶胃蛋白酶热修复：0.01M柠檬酸缓冲液，PH=6.0，95℃，10分钟注意：脱片多——多聚L赖氨酸干片选医用微波炉酶消化：1.细胞内抗原——0.1%胰蛋白酶20’37℃2.间质抗原—

6、—4%胃蛋白酶37℃，4-8小时(八)免疫组织化学的发展1.免疫PCR：主要用于临床生物分子检测方面血清(Ag)电泳+Ab+无关引物扩增→显色意义：1.原来较弱、水平较低的酶等，用免疫PCR就可以检测出来2.需要较长或一定时间才能查出来用免疫PCR法，就可提前查出来如：病毒性心肌炎、血肿CPK检测心梗早期心肌酶谱的检测等心梗预报：心绞痛→一般认为没有酶谱改变，设想用免疫PCR就可能发现改变2.原位免疫PCR在组织切片上有定位Ag+Ab1+Ab2→卵白素→洗净→生物素标记的DNA片断→洗净→原位PCR扩增→洗净→ACB或S-P显色特点：①提高阳性率②定位好2.扩增：Tot

7、al:25μl①PCRbuffer2.5μl②mixeddNTP2.0μl③dH2O16.375μl④primer11.0μlprimer21.0μl⑤Taq0.125μl⑥DNAtemplate2.0μl94℃25”→55℃25”→72℃40”30cycles3.Agarose2-5%，用1×TBE电泳①扩增后液5μl+1μlloadingbuffer②溴化乙淀染色20’，UV照射下确认泳带→照相4.DNA收集RECOCHIP法三、WesternBlotting1.提取蛋白①500μl的hypoton