反相微胶团萃取技术

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1、第四章反相微胶团萃取技术（ReversedMicellesExtraction）传统溶剂萃取技术的的缺点：1）一些被分离对象（如蛋白质）在40-50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质变性。2）萃取剂问题：蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。反胶束的优点极性“水核”具有较强的溶解能力。生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，

2、增加其结构的刚性，提高其反应性能。反胶束萃取优点：具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。此外，反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。一、反胶束萃取原理和制备1基本原理表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，便形成聚集体,称为正常胶束；表面活性剂溶于有机溶剂，当浓度大于临界胶团浓度时，会在有机相中形成聚集体,称为反胶束。反胶

3、束中极性头朝内，非极性尾朝外排列形成亲水内核，称为“水池”。萃取时，待萃取的原料液以水相形式与反胶束体系接触，调节各种参数，使其中要提取的物质以最大限度转入反胶束体系(前萃取)，后将含该物质的前萃液与另外一个水相接触。再次调节pH、离子强度等参数分出要提取物质。2体系性质反胶束体系的性质常用参数W0(或R)，θ，与N来表示，其中W0为水与表面活性剂的摩尔比，θ是增溶水相对总体积的浓度，N是组成每个反胶束微粒的表面活性剂分子个数(聚焦数)。当W0一定时，θ与N决定了胶束微粒的相对浓度，其中最重要的参数为W0

4、。W0反映的是反相微胶团中的水分含量，是非极性溶剂中的水浓度和表面活性剂浓度之比。即：W0=[H2O]/[表面活性剂]。W0越大反相微胶团内水分越多，形成的反相微胶团半径越大，能溶解的水溶性成分就越多。因此，W0大小可以反映出反相微胶团的大小和溶解能力。3增溶动力学蛋白质在反胶束中增溶，普遍认为动力是蛋白质表面的电荷与形成反胶束内表面的表面活性剂极性头之间的静电引力，如AOT(丁二酸-2-乙基已基酯磺酸钠)/异辛烷形成的反胶束中，AOT是阴离子表面活性剂。当原料样pH

5、>pI则增溶小。离子强度也有类似现象，很多研究表明蛋白质与表面活性剂间的疏水作用也有很大作用。反胶束中，酶的动力学与水中相似，只是由于酶与表面活性剂作用，底物分配和交换，因而Km(米氏常数)Kcat(转换数)是复杂的多变量函数。4制备方法目前常用转移法、注入法、溶解法制备反胶束体系。相转移法：将含有生物大分子的水相与溶解有表面活性剂的有机相接触，缓慢搅拌，在形成反相微胶团的同时，其中的生物大分子就转入到反相微胶团中，直到萃取处于平衡状态。见书P37图4-4a。注入法：将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面

6、活性剂的有机相中，从而实现萃取过程。见书P37图4-4b。溶解法：常用于固体粉末中的生物大分子或不溶于水的生物大分子的分离。操作过程是先制备好含水（w0=3~30左右）的反相微胶团的有机溶液，然后把含有生物大分子的固体粉末加入并搅拌，生物大分子慢慢的就可进入到反相微胶团内的水中心而达到分离萃取效果。见书P37图4-4c。二、反胶束溶液形成的条件和特性反胶束溶液的关键因素：反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶束(reversedmicelle)是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集

7、体，所以表面活性剂是反胶束溶液形成的关键。表面活性剂表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见下表在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT，丁二酸-2-乙基己基磺酸钠)。这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋

8、白质进入。(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲铵常使用的阳离子表面活性剂(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲铵将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表