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1、Snapshot技术平台 SnaPshot技术平台是AppliedBiosystems,ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒可对多个SNP位点同时进行基因分型,也被称为minisequencing。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Genemapper分析,可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。这个平台是建立在3730，3130等PCR测序仪上的技术。3730XL型DNA序列检测仪一. SnaPshot工作原理应用SNaPshot进行定点的序列分析,其基本原理遵循
2、了DNA直接测序中的双脱氧终止法,所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点,因此每一种引物在聚合酶作用下,根据模板的的序列,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统,检测延伸的那个核苷酸的种类。1．多重SNaPshot反应的工作原理：在一个SNaPshot反应体系中，针对每个待测SNP位点在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物），引物的Tm值要求在50度以上，在AmpliTaq聚合酶和4种不同荧光标.记的ddNTP存在的情况下,各条引物与各自互补的DNA模板结合,聚
3、合酶在引物的3’末端延伸单个碱基反应即告终止,产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5’末端加上不同长度的PolyC或PolyT，使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为20bp,相邻两个SNP的引物之间长度一般相差4-6个核苷酸，以便区分。多重SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP而最终达到区分不同SNP位点的作用,一次反应可以同时对4-5个SNP进行基因分型,是一种通
4、量较高的基因分型的方法。图1SnaPshot实验原理图解2．多重SNaPshot反应的工作通量工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量就是6000个GENOTYPING，是中等通量的检测。二. SnaPshot工作流程1．引物的设计SNAPSHOT可以检测多重的SNP，我们一般选择4－5个位点做一个组合。现对这些目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值
5、在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP,设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。引物设计注意事项：1．同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。2．引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50°C。3．为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的poly(dA)尾巴互补。4．引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、
6、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显著，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于36个碱基时，ABI强烈建议用户使用PrimerFocus试剂盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。5．合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用HPLC方法纯化。1．在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。进行多重SNaPshot反应时,需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性,对引物的设计要求是尽量保持相近的Tm值,否则会引起非特异性产物的扩增,造成碱基误读。
7、另外,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重SNaPshot反应相比,多重反应不但节省了反应时间,还大大减少了试剂用量,降低了反应成本。位点SNPPCRLEFTPRIMERTMPCRRIGHTPRIMERTM长度SNP1c/tGAGCCAGAGGAGGATGTTGA60.35GGCTAGAAGGAGCGAGGACT60.12248SNP2C/TACGTTGCAGTTGCCTTTCTT59.92GACTCTGCAGTGAGGCCCTA60.55210SNP3A/GCCTTGATACCACGTGCATTG59.99TTCTTC
8、AGCCTCTGCCATTT59.96185SNP4C/GTCAAGCCCAGTCCTTTCTGT59.84CCCAATAGCCGTATCTGGAA5
