近红外荧光成像技术——定量Western Blot的新标准

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1、近红外荧光成像技术-定量WesternBlot的新标准基因有限公司李春燕化学发光检测近红外荧光检测680laser800laser11/10/2012化学发光检测红外荧光检测酶促化学反应，无法准确定量信号恒定，准确定量暗房曝光荧光成像膜上无法直接观察到Marker膜上直接观察到Marker两种蛋白检测需Strip两种蛋白同时检测11/10/2012近红外荧光成像技术•荧光——准确定量、线性范围宽广•红外——背景低、信噪比高•双色——同时检测、同时输出荧光－准确定量化学发光荧光•动态信号－信号随时间变化•静态信号－信号不随时间变化•信号不与目标蛋白

2、浓度成比例关系•信号和目标蛋白浓度成比例关系SaturationINTENSITYBackground0,00,0TIMETIMEHighconcentration/Mediumconcentration/Lowconcentration/signalsignalsignal红外荧光VS化学发光定量线性范围更宽化学发光法近红外荧光法•近红外荧光法能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高）•近红外荧光成像呈现一个很好的线性（定量准确）MooseImaging–Signal/BackgroundBackgroundHighS/BLowS/B近红外：低背景，高信噪比近红外荧

3、光的波长范围在700-800nm之间，避开了NC膜、PVDF膜微孔板等耗材的本底信号，提高了检测的信噪比和相对灵敏度11/10/2012红外荧光－直接检测Infrareddye(IRD800,Alexa680)膜上抗原一抗结合红外标记的二抗Odyssey直接扫描不需要底物不需要底片/暗室信号持久Odyssey—双色同时检测•两套独立激发检测系统•700通道：680nm激发720nm检测•800通道：780nm激发820nm检测800nm700nmOverlay双色－定量western检测TargetproteinAnti-rabbit800channelN

4、ormalizertargetAnti-mouse700channel杂交条件均等，结果同时输出，直接比对11/10/2012双色－蛋白磷酸化—+EGF—+EGF—+EGF800nm700nm700and800channelchannelnmERKphosphoERKResultsOverlaidEGF刺激后A431细胞，ERK1andERK2(p44/42MAPkinases)磷酸化情况,一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用抗兔的IRDye800标记的抗体(green),和抗鼠的Alexa680标记的抗体(red)。叠加后为黄色，黄色的深浅

5、即代表了磷酸化水平的高低，并且可以通过软件进行准确的量化分析。NIREMSA-告别同位素！（体外核酸和蛋白相互作用）700nmChannel700and800OverlayDNA-ProteinComplexUnboundDNAIRDye800800nmChannelUnboundDNAIRDye700BindingofT7RNAPtotwoDNAfragmentscontainingtheT7promotersequence,labeledwitheitherIRDye700(red)orIRDye800(green).11/10/2012In-CellWes

6、ternAssay细胞处理效果和药物筛选的最佳选择In-CellWesternAssay快速、高通量、重现性好膜上WesternIn-CellWestern细胞培养√√细胞刺激√√固定和透化√细胞裂解√上样√电泳√转膜√孵育抗体√√成像√√通量12sample/Gel96或384/Plate11/10/2012NIR-小动物活体成像低GFPRFPIRDye®高背信景噪比•组织和细胞对近红外波长的光信号吸收最低•红外波段，光的散射更低•在近红外波长范围，自发荧光更低11/10/2012波长特异性激光器作为激发光源SourceExcitationQualityExc

7、itationBackgroundOverallLightofLightEfficiencyNoisePerformance800nm800nm800nm800nm800nm800nmNIRLaserLowerMoreLightBetterCleanerBetterBenefitPowerExcitationDetectionSensitivityEfficiencyLEGENDAbsorptionSpectraofDyeEmissionSpectraofDyeLightSpectra(Source)NoisePearl活体成像流程简单Customlabelin

8、gEGF-IRDye80