使用imagepro-plus测量荧光强度

《使用imagepro-plus测量荧光强度》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、使用imagepro-plus测量荧光强度如今，使用荧光染料进行免疫组化染色的实验非常普遍，荧光染料染色细胞的荧光强度也能反映细胞中相关蛋白的表达强度，自然而然的，大家会想到是否可以通过IPP分析细胞或组织切片的荧光照片来分析其荧光强度，并以此来表示相应蛋白的表达强度。非常令人沮丧的是，这个想法是很难实现的。这个网页详细说明了理由。http://support.mediacy.com/answers/showquestion.asp?faq=36&fldAuto=325里面的结论是：YouDON'T!ImageProPluscanprovideIntensityorDensitymea

2、surementsforanyimage.However,unlesstheimageacquisitionssystemisproperlycalibrated,thosenumbersmaynothaveanyusefulrelationshipwiththerealworld.IPP的分析结果与实际情况是有很大误差的，这个误差不是IPP的错，而是在制作样品及拍摄照片的过程中引入的。所以在介绍使用IPP分析荧光照片的方法之前，首先得说说如何拍摄荧光显微镜照片。这可能比IPP的操作还要重要。荧光显微镜拍摄的样品，是使用荧光染料染色的，使用荧光显微镜时最重要的，是选择合适的激发光滤光片

3、与荧光滤光片。正确选用滤光片能得到足够强的荧光，但一般情况下，显微镜不可能配齐所有的滤光片，更何况现在的显微镜滤光片价格都很贵，只能求其次，使用波段相近的滤光片，荧光强度稍低一些。粗略的选择是：红色荧光染料，使用红色截止滤光片与绿色激发滤光片。绿色荧光染料，使用绿色截止滤光片与蓝色激发滤光片。蓝色荧光染料，使用蓝色截止滤光片与紫激发滤光片。更精细的滤光片选择，可以参照下表：http://home.dlmedu.edu.cn/jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls在拍摄荧光照片时，如果要分析荧光强度，与免疫组化照片一样，要确保每张照片的拍摄条件完全一致。先拿一

4、张荧光最强的样品观察调整显微镜。确定相机拍摄的曝光时间。荧光照片的曝光要注意的事项有：1.使荧光最强的部位不能曝光过度。判断标准是照出的照片在最亮处不能变色。比如绿色荧光照片，当曝光过度时，亮处会变成黄色甚至白色，这就是曝光过度了。过度的曝光会导致测量数值变低。当确定了一个曝光时间后，就必须以这个曝光时间拍摄所有的样品，绝不能使用自动曝光。2.没有样品的空白部位应是纯黑色。这一点不一定能作到。特别是组织切片，由于样品的散射作用，没有荧光的部位也会显示出一点荧光的颜色的。3.荧光样品是有荧光淬灭效应的，当把样品放到载物台上后，要以最快的速度选择视野立即拍照。时间越长荧光越弱，其衰减速度与

5、时间的指数相关。这就是导致荧光强度分析误差巨大的最主要原因。4.使用激光共聚焦显微镜拍摄荧光照片比普通荧光显微镜效果更好，能够更有效地控制所有照片的拍摄条件保持一致。在条件可能时，尽量使用激光共聚焦显微镜来拍摄。5.在拍摄细胞爬片上的细胞时，将爬片的细胞层向上，放置在载玻片上，然后再盖上一片干净的盖玻片。很多人喜欢把爬片翻过来放在载玻片上，直接在镜下观察，这样并不好。爬片背面沾的培养液不易擦净，导致图象不清晰。6.许多情况下，在拍摄一张荧光照片后，还需在同一视野下拍摄一张细胞轮廓的普通光照片。由于没有进行正常染色，这不容易照清楚。有个绝招管用：将显微镜的普通光聚光镜往下降得很低，就能照

6、出较清晰的细胞轮廓照片。7.由于荧光实际上就是单色光，所以最好使用单色冷CCD作为拍摄相机拍摄12位或16位的灰度图片。不过一般的显微镜现在基本都是使用彩色CCD的。在设备可能的条件下，要拍摄12位或16位的图像。比如Olympus的DP70相机就可以拍摄这样的图片，图片文件会大一点，但对荧光照片的分析是大有好处的。拍摄完图片之后，在分析之前，还需对图片进行一下转换处理。荧光图片上，表达最强所对应的是图片上的亮处，背景则是黑色的。这与免疫组化图片正好相反。所以要先把荧光图片作一个黑白反相处理。IPP当然是可以作这件事的。其他的图象软件也都能作。如果使用IPP来Invertcontras

7、t，一定要记得Invert之后还要applycontrast一下，否则图片实际上是并没有改变的，它只是显示成了反相。反相后的照片另存到另一个子目录中用于测量，原始照片是必须保留的。这个反相的照片可以是彩色的，也可以是黑白的。最好转换成黑白的。下面就可以测量荧光强度了。甚至方法还简单一些：在选色时，只需调整背景强度就行了。先测量一下没有荧光部分的灰度，比如测得背景值是240，那就在光密度校正中选择240作为背景，在HSI选色中只需考虑强度而不必考