论小麦高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达

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1、科技大学届毕业论文（设计）题目：论小麦高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达姓名：专业：生物技术指导老师：院（系）：生命科学学院完成日期：小麦高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达摘要关键词前言材料与方法结果与分析讨论结论参考文献致谢摘要用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pMD－HMW,回收长约2.2kb的高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因，将其亚克隆到表达载体pET-30a(+)的相应位点上，构建了该基因的原核表达载体pET-HMW。SDS-PAGE分析结果显示，

2、经IPTG诱导，高分子量谷蛋白14亚基(HMW-GS14)基因在大肠杆Rosetta(DE3)pLysS中得到了表达。AbstractAfterslicingthepMD-HMWwithtworestrictionendonucleasesEcoRⅠandSalⅠ,recollectthehighmolecularweightgluteninsubunit14(HMW-GS14)genewhichisabout2.2kbinlength,thensubcloneitintotherelativesiteoftheexpr

3、essionvectorpET-30a(+),andeventuallytheprokaryoticexpressionvectorpET-HMWisconstructed.TheanalysisresultofSDS-PAGEshowsthatafterinductionofIPTG,thehighmolecularweightgluteninsubunit14(HMW-GS14)geneisexpressedintheE.coliRosetta(DE3)pLysS关键词高分子量谷蛋白14亚基基因原核表达亚克隆Keyw

4、ordsHMW-GS14geneprokaryoticexpressionsubclone前言小麦是最重要、种植面积最广的粮食作物之一。由于高产量新品种的选育推广、耕作栽培技术的提高及农业投入的增加，我国小麦产量不断提高，数量上暂时告别短缺。然而，随着社会饮食业、旅游业的发展和人民生活水平的提高，以小麦面粉为原料的各种精致面食和方便食品、保健食品及营养食品的生产增长很快，使得全国各地对小麦特别是优质小麦的需求，呈现不断增长的势头，并对小麦的品质提出了更高的要求。小麦的加工品质与小麦种子中麦谷蛋白及醇溶蛋白的含量和组成关系

5、极为密切，高分子量麦谷蛋白与加工品质之间的关系已通过遗传、分子结构分析、显微电镜等方法得以阐明。在不同高分子量麦谷蛋白亚基对加工品质的贡献的研究中,发现5+10亚基为优质亚基，而2+12亚基为劣质亚基。然而我国的一些优质小麦品种如小偃6号（亚基组成为1，14+15，2+12）等缺乏5+10，而且具有被认为是劣质的2+12亚基。分析结果表明，导致其优质的原因在于其所具有的14+15亚基，14+15亚基具有5+10亚基的功能。因此，研究14+15亚基功能对于从分子水平上改良小麦品质具有重要意义。本研究拟在以前的工作基础上，构

6、建高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达载体，并实现其在大肠杆菌表达宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS中的特异表达，为进一步纯化HMW-GS14及研究其功能、性质奠定基础。材料与方法（一）材料（二）方法（一）材料1.菌株和质粒：大肠杆菌JM109菌株、Rosetta(DE3)pLysS菌株、含HMW-GS14基因的重组质粒pMD-HMW以及原核表达载体pET30a(+)均为本实验室提供。2.酶与试剂：限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有

7、限公司，T4DNAligase购自Promega公司，其他酶与试剂均为本实验室常规储备。（二）方法1.pMD-HMW的提取2.pMD-HMW的酶切鉴定3.连接反应4.感受态细胞的制备5.转化6.菌落PCR7.重组表达质粒pET-HMW的提取与酶切鉴定8.重组表达质粒pET-HMW转化表达宿主菌9.诱导表达及SDS-PAGE分析1.pMD-HMW的提取挑取含有重组质粒pMD-HMW的单菌落，接种于5mlLB液体培养基中（含氨卞青霉素100ug/ml）,于37℃，180rpm振摇培养12～14h。含有原核表达载体pET-30

8、a(+)的单菌落（卡那霉素50ug/ml）做相同处理。然后按照“SDS碱裂解法”小量制备质粒pMD-HMW和pET30a（+）。2.pMD-HMW的酶切鉴定用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒pMD-HMW。在20ul酶切体系中，加入10ulpMD-HMW、2ul10×buffer、1ulEcoRⅠ、1u