氢氘交换质谱技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用

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1、生物物理学报2013年11月第29卷第11期：811-822ACTABIOPHYSICASINICAVo1．29No．11Nov．2013：811—822WWW．qb．org．on氢氘交换质谱技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用陆海荣，黄青山，1．复旦大学生命科学院遗传学研究所，遗传工程国家重点实验室，上海2004332．上海高科联合生物技术研发有限公司，上海201206收稿日期：2013．07—24；接受日期：2013．11-04通讯作者：黄青山，电话：(021)65642814，E．mail：qshuang@fudan．edu．cn摘要：氢氘

2、交换质谱法(hydrogen／deuteriumexchangemassspectrometry，H／DX-MS)是一种研究蛋白质空间构象的新技术，蛋白质主链氨基氢原子和重水溶液(D20)中氚原子的交换过程可用来研究蛋白质空间结构。H，DX．MS包括五个基本步骤：样品氢氘交换反应、终止反应、样品酶解、质谱检测和数据分析。目前，该技术已被广泛应用于蛋白质的结构、结构动态变化及蛋白质相互作用等方面的研究．与经典的X．射线蛋白质结构研究方法形成互补。文章介绍了H／DX．MS的基本原理和技术流程，并综述了H／DX．MS在蛋白质相互作用研究中的应用情况。关

3、键词：氢氘交换；质谱；蛋白质相互作用中图分类号：065DoI：10．3724／SP-J．1260．2013．30108引言早在上世纪50年代，Hvidt和Linderstrom—Langt】就注意到蛋白质中氢原子和重水溶液(D：O)中氘原子的交换现象。此后，越来越多的研究人员报道了这种氢氘交换(hydrogen／deuteriumexchange，H／DX)现象[2。随着质谱(massspectrometry，MS)技术的发展，研究人员结合H／DX和MS方法形成一种研究蛋白质结构的新技术——氢氘交换质谱法(H／DX—MS)。该技术自1991年第一

4、次应用[6]以来，已广泛用于蛋白质的结构和结构动态变化方面的研究，涉及蛋白质的折叠过程【7~“】、蛋白质与配体结合后的结构变化【～5"1、蛋白质分子间的相互作用界面[16~241、由多个亚基组成的蛋白多聚体(包括病毒衣壳蛋白)的空间构象[25~31]、蛋白质分子中结构域之间的相互作用界面[32,33】、蛋白质与小分子配体相互作用]34-38]、蛋白质与DNA相互作用[39~42]、蛋白质与膜的相互作用[38,43]、翻译后修饰f糖基化、磷酸化和谷胱甘肽化1，以及点突变对蛋白质结构的影响[44--50]等。H／DX．MS技术已经成为结构生物学中一个

5、非常重要的研究方法[51~59]，与经典的x．射线蛋白质结构研究方法相比，H／DX．MS具有以下优势：1)蛋白质在溶液中处于天然状态；2)可分析蛋白质动态变化过程；3)质谱检测灵敏度高，蛋白质样品用量少(微克级)；4)质谱分析速度快，极大缩短实验周期；5)质谱设备非常普遍，降低了实验门槛。本文将介绍H／DX-MS的基本原理和技811—MS研究蛋白质分子间相互作用术流程，以及应用H／DX、蛋白复合体结构方面的研究进展。H／DX．MS的基本原理当蛋白质用重水溶液稀释后，蛋白质分子中不稳定的氢原子和重水溶液中的氘原子进行交换。不稳定氢原子主要包括蛋白质

6、分子中与支链上氮、氧、硫相连的氢原子，以及主链酰胺键中氨基的氢原子(图11。那些和碳原子相连的氢原子则不会发生氢氘交换。位于支链卜不稳定氢原子的氢氘交换速率非常快，交换上去的氘原子在实验后期离开高浓度重[,ol水环境后，很快被溶液中的氢原子回复交换下来，很难用质谱的方法检测N。而主链氨基氢原子的氢氘交换速率相对缓慢，可以被质谱方法检测到。因此，主链氨基氢原子与重水溶液中氘原子的交换过程可以被用来研究蛋白质结构。图1蛋白质在重水溶液中的氢氘交换现象‘示意图j支链l：氮、氧、硫丰¨连的氧原f以及主链酰胺键中氨基的氰原f可以和重水中的氘原子发生交换反应

7、，而和碳原子相连的氡原子小会发牛氧氘交换Fig．1Schematicdiagramofhydrogen／OdeuteriumexchangeinproteinsIiydrogenatomslocatedwithinthebackboneamideandtheaminoacidsidechainscanexchangewithdeuteriumatomsintheD0solvent．howeverhydrogenatomsbondedtocarboncannotexchange主链氨基氢原子氢氘交换的速率主要受三个因素影响一一[s”。第，溶液pH。

8、通过对不同pH条件下肽段氢氘交换率的分析发现，在pH2．5左右时氢氘交换的速率最低；当溶液pH。[60l从7．0下降至2．5时，氢氘交换