慢性应激抑郁型小鼠黄褐斑实验动物模型的研究--硕士论文

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1、中国医科大学硕士学位论文慢性应激抑郁型小鼠黄褐斑实验动物模型的研究姓名：申宇鸿申请学位级别：硕士专业：皮肤病与性病学指导教师：耿龙20090301·中文论著摘要·慢性应激抑郁型小鼠黄褐斑实验动物模型的研究刖旨黄褐斑的病因复杂，主要致病因素有紫外线照射、内分泌失调、情绪变化等。长期紫外线照射可使黑色素细胞增殖，而黑素的生成是酪氨酸酶一系列氧化反应并使体内氧化与抗氧化过程出现异常，如过氧化脂质(LPO)升高、SOD下降等，所以可以通过皮肤黑色素病理形态学，LPO的衍生物MDA及SOD量的变化研究黄褐斑实验动物

2、模型。本课题采用慢性应激刺激法致小鼠出现抑郁症状，用雌激素(黄体酮)全身攻击小鼠，并同时对其进行局部照射紫外线来建立黄褐斑实验动物模型进行探讨，并与其他小鼠黄褐斑实验动物模型进行对照研究。目的通过给小鼠进行紫外线照射局部、注射黄体酮和慢性应激抑郁刺激法综合作用，建立慢性应激抑郁型小鼠黄褐斑实验动物模型，并与紫外线照射动物模型建立的方法对比观察。材料与方法一、材料1、动物健康雌性BALB／C小鼠，清洁级(军事医学科学院实验动物中心提供)。2、实验药品和试剂黄体酮注射液20mg／ml，超氧化物歧化酶(SOD)

3、试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，HMB45鼠单克隆抗体(英国abeam公司)。3、实验器材德国DuaLi曲m71VrA^ⅣB高能紫外光治疗仪(UVl20-2)；CM队S多功能真彩色病理图像分析系统2000型(空军总医院与北京航空航天大学共同研制的)。二、方法(一)动物分组取小鼠30只，随机分为3组：正常组6只、紫外线组12只、慢性应激抑郁组12只。造模时间，第一批小鼠实验进行21天，第二批小鼠实验进行28天。(二)实验分组1、正常组：每周脱毛1～2次，每天肌肉注射注射用水5ml／

4、kg体质量，连续21天观察小鼠的脱毛部位皮肤变化情况。2、紫外线组：先通过预实验得到BALB／c小鼠皮肤长波紫外线(小，A330nm～380rim)最小光毒量(MPD)为10J／m2，中波紫外线(UVB304nm--一311nm)最小红斑量(MED)为660mJ／C1112。根据预实验得出照射方法，第1天以0．7MPD+O．7MED每日照射一次，连续照射6天，第7天小鼠皮肤出现轻微结痂脱屑，停止照射2天；第9天、第12天以0．5MPD+0．5MED照射一次，第16天、第19天以0．25MPD+0．25ME

5、D照射一次；第一批照射21天。第二批在停止刺激后一周处死。3、慢性应激抑郁组：按照经典抑郁模型加以改进处理方法：紫外线照射方法同紫外线组。每日肌肉注射0．4％黄体酮5ml／kg体质量，第一批小鼠连续21天。第二批小鼠在停止全部刺激后一周处死。(三)抑郁模型测定l、旷场实验2、实验开始结束时小鼠体质量(体重)变化3、液体消耗试验(四)MDA及SOD活性测定同时取肝脏及脱毛部位皮肤，用预冷生理盐水(4℃)冲洗，除尽杂质，拭干，切取皮肤0．29、肝脏0．59，分别放入有9倍于组织块的预冷生理盐水的小试管内，将剪

6、碎的组织倒入玻璃均浆管中，上下转动研磨20"-'30次，充分研碎，使组织均浆化。均浆后以3500r／rain离心8分钟，取上清液采用试剂盒检测MDA、SOD活性。(五)皮肤黑色素细胞的病理形态学观察第一批小鼠当脱毛部位皮肤出现明显的色变(照射21天)，取去毛皮肤1块2(1cmxlcm)，10％福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。再经脱蜡至水、抗原修复后，应用免疫组织化学法，用HMB45为第一抗体，免疫组化二步法，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗做阴性对照。第二批小鼠在实验28天后处死取皮，余病理步骤同

7、上。(六)黑色素阳性目标用计算机进行图象分析每张切片在显微镜物镜40X下，随机选择5个视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野的形态学阳性目标(靶目标)中的数密度、光密度参数的总和平均数，各组间参数的标准差(；士S)、标准误、变异系数。(七)统计学分析SPSS12．0统计学软件，数据以(；士S)表示，进行方差分析，凇验。结果一、抑郁模型黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁组小鼠的穿格次数、直立次数、理毛次数均较正常组有所减少，并有显著差异。体重增加最少，糖水消耗显著低于正常组f，P<0．05)提示慢性应激刺激2

8、1天后的小鼠出现了抑郁的征象。二、MDA及SOD的水平在5组中，紫外线组、慢性应激抑郁组两种模型小鼠肝脏与皮肤的MDA水平均较正常组升高，SOD活性较正常组有所下降。其中，慢性应激抑郁组21天组小鼠皮肤SOD经统计学处理有极显著性差异(p<傀口砂，慢性应激抑郁组28天组小鼠皮肤、肝脏MDA有极显著性差异p姐口矽。提示这种模型建立法对于小鼠皮肤、肝脏MDA、SOD的活性影响非常大。三、皮肤黑色素细胞的病理形态学结果(一)小鼠表皮