腾冲地热区可培养细菌多样性及氨氧化古菌的富集研究

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1、AstudyonBacterialdiversityandenricIimentOIammonla-oxicl忆inRArcIIaea‘l‘●●●1●●▲l一●⋯fromgeothermalregionofTengchongdissertationSubmittedtoYunnanUniversityinfulfillmentoftherequirementfortheawardoftheMaster’SDegreeTian—TianYuSupervisedbyProf．Dr．Wen-Jun．LiYunnanInstituteofMicrobiol

2、ogy,YunnanUniversity,Kunming，650091，Yunnan，P．RChina．2013．05独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果，对本文的研究做出贡献的集体和个人均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：盒塑至望日论文使用和授权说明期：如f；、‘。；，本人完全了解云南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文和论文电子版；允许论文被查阅或借阅

3、；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵循此规定)研究生签名：蛔煎导师签名：主塑日期：!!三16：)本人及导师同意将学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)屯子杂志社”进行电子和网络出版，并编入CNKI系列数据库，传播本学位论文的全部或部分内容，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。研究牛签名：导师签名：2日期：摘要云南省是中国热泉资源最丰富的地区之一，其中以腾冲最为集中。本实验室在前期关于云南腾冲地热微生物群落结构的研究工作中，通过16SrRNA基因

4、特异性片断克隆文库的构建和古菌氨氧化基因(amoA)的研究，发现腾冲热泉中存在较为丰富的高温细菌和氨氧化古菌类群。本研究通过探究适合高温细菌的分离方法及氨氧化古菌的富集、纯化方法，达到并获得尽可能丰富的高温细菌类型和纯度较高的氨氧化古菌的富集培养物。首先，通过选用8种分离培养基并采用不同温度梯度分离方法，从云南腾冲地热区13个样品中共分离出279株细菌，根据形态特征，在同一分离平板内去重复后，得至lJl50株细菌，并完16SrRNA基因序列的测序。根据16SrRNA基因序列分析，分离菌株共分布在5个门7个纲11个目14个科的26个属中，栖热菌属(T

5、hermus)，亚栖热菌属(Meiothermus)，厌氧芽孢杆菌属■noxybacillus)是分离频率最高的类群。对部分相似性较低的菌株进行16SrRNA基因全序列测序和系统进化树分析，发现了12个潜在新种和3个潜在新属。通过形态与培养特征、生理生化特征、化学指标特征、基于16SrRNA基因序列系统发育分析和基因组DNA．DNA杂交实验，确定了8株菌的分类地位，本文主要介绍了Thermus属的3个新种的多相分类研究工作。另外，本实验根据腾冲热泉的水化学参数特征选择适合腾冲样点的氨氧化古菌的富集培养基，并采用梯度稀释和添加抗生素的方法获得了可持续

6、传代培养的氨氧化古菌富集培养物，编号为HMZ．20。16SrRNA基因克隆文库中古菌的16SrRNA基因序列均为同一条序列，与分离自美国黄石公园的Nitrosocaldusyellowstonii相似性最高，为96．2％，在构建的系统进化树中HMZ一20同样也与Nitrosocaldusyellowslonii聚在一枝。克隆文库中细菌的16SrRNA基因序列同样均为同一条序列，为栖热菌属的一个新种(已经获得纯培养，已完成菌株分类鉴定工作)。电镜结果显示，HMZ一20的形态为短杆状，宽度为0．35．0．50pm，长度为O．80．1．2p．m。FISH

7、结果显示，氨氧化古菌的数量相对于细菌的数量占优势，并初步研究了其生理特征。关键词：腾冲地热区；细菌；16SrRNA基因；多样性；氨氧化古菌AbstractYunnanprovinceisoneofthemostsubstantailgeothermolresourcesinChina，andTengchongisthemostconcentratedregion．Accordingtothepreviousresearchresults，ofwhichmainlybasedon16SrRNAgeneandamoAgenepartialsequenc

8、es，thereareexistingcomparativelyabundantbacteriaandammonia-ox